壳寡糖 - 硒纳米植物营养调节剂的研制与应

用

第35卷第10期 2008年i0月 湖南大学(自然科学版) JournalHunanUniversity(Natura[Sciences) VoI_35.No.1O Oct.2008 文章编号:1674—2974{2008)10—0060—05

壳寡糖一硒纳米植物营养调节剂的研制与应用 童春义,肖苏尧,王贝,萧小鹃,郑元青,薛昌刚,汪启明,刘选明十 (湖南大学生命科学与技术研究院,湖南长沙410082)

摘要:以壳寡糖为模板,利用复凝聚法制备了壳寡糖一硒纳米颗粒.用 透射电子显微

镜和Zeta—sizer电位分析仪对颗粒进行表征,发现所制备的颗粒为球 状颗粒,平均粒径为

100nm左右,表面带弱正电性.纳米颗粒在4℃条件下保存比较稳 定,25℃以上使用有利

于硒元素的释放.壳寡糖一硒纳米颗粒作为植物营养调节剂应用于水 稻种植,试验表明,在

水稻孕穗期和齐穗期使用均能显着提高稻谷中硒含量,分蘖期使用无 明显富硒情况.孕穗期

使用该营养调节剂,稻谷产量提高了8%～l5%,硒含量提高了3～10倍,

大米中营养物质

总抗氧化能力提高了30%～60%,对硒纳米颗粒的作用机制进行了初 步探讨认为,壳寡糖

硒纳米颗粒,在植物体内缓慢释放硒元素,促进了植物对硒元素的吸 收,硒元素稳定富集

在大米胚乳中.

关键词:复凝聚;壳寡糖一硒纳米颗粒;植物营养调节剂;大米品质 中图分类号:O613.52文献标识码:A

PreparationandApplicationofChitooligosaccharides—selenium NanoparticlesforPlantNutritionRegulator

T O N G C h u n — y i , X I A O S u — y a o , W A N G B e i , X I A O X i a o — juan,ZHENGYuan—qing,

XUEChang—gang,WANGQi—ming,LIUXuan—ming十 (InstituteofLifeScienceandTechndogy,HunanUniv,Changsh,Hunan41008 2.China)

Abstract:Chitcoligosaccharides-Seleniumnanoparticles(SeCSNPs)weresynthesizedusingchitooligosaccharidesaS thetempletthroughcomplexooacervation.Thenanoparticleswerecharacteriz edwithtransmissionelectronmicroscope

andZeta-

Sizermeasurements.Theresultsshowedthattheaveragesizewasabout100nrn. thesurfaceWaSofaweak

positivecharge,andthenanoparticlesweresphere.At4℃particleskeptrelative lystable,andmorethan25℃WaSuse—

fulforthereleaseofelementalselenium.Se-

CSNPsaSaplantnutrientregulatorusedinriceplantingWaSfoundinthe bootingstageandfullpaniclestagecouldincreasetheSeoontentobviously,buti nthestoolingstageWaSnotveryeffec—

tive.Usedinthebootingstage,riceproductionincreased8%～

15%,seleniumcontentincreased3～10timesandtotal

a n t i o x i d a n t c a p a c i t y i n c r e a s e d 3 0 % - - 60%.ThemechanismofactionWaSdiscussedpreliminary,andobtainedtheco nclu—

sionthatSe-

CSNPswouldreleaseseleniumslowly,especiallyinplant,thenincreasedtheeff ectofenrichmentandstabili—

tyinthericeendosperm. Keywords:complexation;chitooligosaccharidesseleniumnanopartides;plantnutrientregulators;ricequality 壳寡糖(chito.oligosaccharide,CS)是壳聚糖经水解生成的一类低聚物, 是指由2～12个单糖通过 收稿日期:2008-04-16

基金项目:湖南省生物纳米技术重大专项经费资助项目(03NKY1001) 作者简介:童春义(1981一),男,江西余江人,湖南大学博士研究生 十通讯联系人,E—mail:sw_xml@hnu.cn 第10期童春义等:壳寡糖一硒纳米植物营养调节剂的研制与应用61 糖苷键连接而形成的直链或支链的低度聚合物.因 其具有较高的溶解度,很容易被吸收利用,特别是分 子量低于10000的壳寡糖展现出更独特的生理活 性和功能性质l1J.在植物生长调节及抗病等农业领 域得到非常广阔的应用-2叫J. 植物体中少量硒能够消除氧自由基,延缓叶片 的衰老,同时还可以修复强光对叶绿素的破坏,使 叶片的光合作用相对增强5,从而促进植物的生 长,增加籽粒的产量,改善果实的品质J,在肥料 中添加硒化合物,应用于水稻生产中,能促进水稻的 增产和使稻谷富硒[.吴永尧等[,]研究了水稻对 硒的耐受,以及对稻谷中硒蛋白的影响,证明了通过 外加硒源物质可以使硒富集在水稻籽粒中,而且是 以硒蛋白的形式存在.将硒源物质吸附在生物相容 性的天然多糖上有助于植物体对硒的吸收和富 集【1...本研究结合壳寡糖在农业中的应用和纳米制 备方面的优势,将硒与壳寡糖化合,制备了以壳寡糖 为模板的有机无机纳米复合材料.将该材料和以壳 聚糖为模板制备的红色硒纳米颗粒同时作为植物营 养调节剂应用于水稻中,比较两种硒纳米颗粒的使

用效果,以选择更适合于开发硒含量稳定,富含抗氧 化物质的大米的纳米营养调节剂,开拓纳米技术在 农业领域的应用. 1实验部分 1.1试剂与仪器 试剂:壳寡糖(Mw<5000,脱乙酰度≥85%), 济南海得贝海洋生物工程有限公司;亚硒酸钠,上海 三浦化工有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯; 总抗氧化能力测试试剂盒购自南京建成生物工程研 究所. 仪器:JEOL1230透射电子显微镜(日本电子); MalvernZeta—sizer3000(英国Malvern公司); Delta320pH计(梅特勒一托利多);XGY-1011A原 子荧光光度计;供试水稻品种晚稻丰优191,国土资 源部地球物理地球化学勘查研究所.

1.2壳寡糖一硒纳米颗粒制备 将一定量亚硒酸钠溶于40mL蒸馏水中制成 亚硒酸钠水溶液,取质量分数为8%的水溶性壳寡 糖50mL,然后把壳寡糖和亚硒酸钠水溶液一起加 入到100mL烧杯中,用冰醋酸调pH至5.0,将溶 液在冰浴下搅拌6h.然后在搅拌的同时滴加1%三 聚磷酸钠至出现乳白色微乳,继续搅拌0.5h,后加 入等体积的无水乙醇醇析,离心分离(4000r/min, 10min).将沉淀物透析10h,再加3倍于体积的乙 醇醇析,离心,分离沉淀,将沉淀用无水乙醇洗涤,真 空干燥,得到壳寡糖一硒纳米微球. 红色纳米硒溶液制备参照文献[11],将壳寡糖 代替壳聚糖作为模板.

1.3壳寡糖一硒纳米颗粒的表征

1.3.1纳米颗粒的形态学表征 上述制备的纳米颗粒分散悬浮于双蒸水中,取 少量滴加在透射电子显微镜专用铜片上,红外光烘 烤至完全干燥,用透射电子显微镜检测颗粒的形态. 1.3.2纳米颗粒的稳定性检测 纳米颗粒用双蒸水分散重悬,在不同温度条件 下保存,每过一段时间取出部分用Zeta—sizer粒度分 析仪进行粒径和表面带电检测.同时以25℃下保存 的壳寡糖(CS)溶液表面带电荷情况为对照. 1.4壳寡糖一硒纳米颗粒作为植物营养调节剂在 水稻中的应用 将上述制备的壳寡糖一硒纳米颗粒以叶面喷施 的方式施加到水稻上,以检测复合纳米颗粒对水稻 的生长和品质的影响.在长沙县黄兴镇做晚稻田间 小区试验,把同一片水稻田分为12块4组,每组3 块,每块10m2.4组分别喷施自来水,红色单质硒水 溶液,壳寡糖一硒纳米颗粒1水溶液和壳寡糖一硒 纳米颗粒2水溶液,称为对照组(CK),红色硒组 (RedSe),壳寡糖一硒纳米1组(Se—CSNP1)和壳寡 糖一硒纳米2组(Se—CSNP2),其中以硒浓度计壳寡 糖一硒纳米2组喷施浓度为壳寡糖一硒纳米1组的 两倍,红色硒组与壳寡糖一硒纳米1组浓度相同.同 时设置小区试验考察壳寡糖一硒纳米1组配方对不 同喷施时期和喷施次数对稻谷硒含量的影响. 1.5田间试验水稻农艺性状检测 对田间水稻株高,穗长,千粒重,有效穗数等农 艺性状测定,并进行产量和结实率等估算. 1.6大米中硒含量,总抗氧化能力的检测 1.6.1大米中硒含量检测

大米中硒含量的检测方法按照国家粮食卫生标 准的分析方法GB/T5009.93—2o03中氢化物原子 荧光光谱法进行检测.将收获的稻谷用砻谷机脱壳 和精白机打精,得到糙米和精米.将精米和糙米用水 洗涤3次,于60℃烘干,分别用不锈钢磨粉碎后,用 硝酸一高氯酸(4+1)混合酸消化过夜,次日加热至 冒白烟,挥发掉混合酸后定容.取10mL消化液加 入浓盐酸和铁氰化钾,原子荧光光度计检测.硒标样 由长沙市矿产资源监督检测中心提供. 62湖南大学(自然科学版)2008正 1.6.2大米总抗氧化能力的检测 大米浸提物中总抗氧化能力的检测方法参照南 京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书中血清 中总抗氧化能力测定方法.首先将收获的稻谷用砻 谷机脱壳和精白机打精,得到糙米和精米.将精米和 糙米用水洗涤3次,于60℃烘干,分别用不锈钢磨 粉碎后,用超纯水浸提24h,取浸提液500r/min离 心取上清液.然后将0.5mL上清液与试剂盒中试 剂1,试剂2和试剂3混匀,37℃水浴温热30min, 加入试剂4后放置10min,蒸馏水调零,520nm测 定吸光度,每个样品管设置对照管一个,按照公式” =0D÷0.01÷30×(“为总抗氧化能力 (单位/mL);7/.为稀释倍数)计算浸提物的总抗氧化 能力,同时定义在37℃时,每分钟每毫升浸提物使 反应体系的吸光度值每增加0.01时,为一个总抗氧 化能力单位.最后按照公式U=“×V÷m(U为 总抗氧化能力(单位/kg);V为浸提物体积;1”//.为大 米质量)计算大米总抗氧化能力. 2结果与讨论

2.1壳寡糖一硒纳米颗粒形成原理 壳寡糖(2_氨基取代多聚葡萄糖)其6羟甲 基,2啦的氨基具有较强的化学反应活性,可在无 机酸或有机酸的催化剂等催化作用下生成酯和酰 胺.在乙酸条件下控制部分活性基团与亚硒酸根化 合,形成壳寡糖一硒复合分子,而剩余的大多数活性 基团仍带有强正电性,与聚阴离子多聚磷酸钠复凝 聚,形成规则的纳米粒子.基于这个原理,我们制备 得到壳寡糖一硒纳米颗粒. 2.2壳寡糖一硒纳米颗粒的表征 2.2.1透射电子显微镜表征 以透射电子显微镜表征壳寡糖一硒纳米颗粒, 得到图1.如图1所示,颗粒呈圆球形,平均直径为 100nm左右,颗粒堆积排列成线状.

图1壳 Fig.1 ×10倍) TEMimageofSe—CSNP(1.5×10times) 2.2.2Zeta.sizer粒度分析仪表征 Zeta-sizer粒度分析仪检测得到颗粒表面的带 9.12mv的弱正电性,颗粒平均直径为98n/n,分散系 数(PdI)为0.231,与透射电镜所得结果基本一致. 2.3壳寡糖一硒纳米颗粒的稳定性 壳寡糖一硒纳米颗粒水悬液放置温度分别为 4℃,25℃和37℃,放置时间分别为0d,1d,2d, 4d,8d和16d,geta-sizer仪检测粒径和颗粒表面带电 性,结果如图2所示.由图可知,壳寡糖一硒纳米颗粒 水悬液在4℃保存具有较好的稳定性,16d过后直径 只增加了40%,颗粒表面带电也只增加了5mV.而在 25℃的条件下,8d后颗粒直径增加近2倍,出现了