＂纳米孔测序技术在传染病防控中的应用进展＂

目录

1纳米孔测序技术在病原体检测与分型中的应用

16SrRNA基因(~1500bp)与rrn操纵子(16S-ITS-23S)是进行微生 物种属鉴定的重要标志

2纳米孔测序技术在疫情溯源中的应用

3纳米孔测序技术在传染病流行规律研究中的应用

正文

摘要：新一代测序技术在病原体检测中起着日益重要的作用，但读长 短、测序周期长、依赖实验室设备环境等极大地限制了其在传染病暴发的快 速诊断与检测中的应用。以纳米孔测序技术为代表的第三代测序技术，不仅 具有超长读长、实时测序、低成本等优点，而且能够对DNA/RNA直接测序， 在病原体检测方面的应用日益广泛。本文针对纳米孔测序技术在传染病防控

中的病原体检测与分型、疫情溯源和流行规律研究等不同领域的应用进展进 行简要综述

关键字：纳米孔测序技术;实时测序;传染病;病原体检测

近年来，新发突发传染病成为威胁人类健康与公共卫生的重要因素，埃 博拉、寨卡等疫情的不断暴发给人们敲响了警钟，这些病原体的快速检测对 于传染病疫情的防控至关重要。新一代测序(next-generatioequencing， NGS)技术可以获得病原体基因组序列信息，解决传统分子生物学方法难以应 对未知或变异病原检测的瓶颈问题[1-4]，提高病原体识别确认能力，并通 过基因组序列分析实现病原体的快速鉴定、精准分型、传染源追溯及传播演 化规律分析，有效降低新发突发传染病造成的公共卫生影响[5-6]。比如， 利用高通量测序预测H1N1的传播流行规律，与传统的流行病学预测结果一 致，为流感防控提供了重要参考[7]。在埃博拉疫情中应用高通量测序研究 埃博拉病毒的演化规律，为深入的流行病学调查提供了关键信息[8]

然而，现有的NGS技术平台体积大不易搬运，测序周期长，且依赖于大量 实验室辅助设备和专业人员操作，在面临疫情暴发或严重感染性疾病的处置 中难以实现快速实时检测，无法应对致病病原识别时效性的需求[9]。且受 限于短读长，NGS测序难以获得具有重复序列的复杂基因组结构的病原体序 列全长，不利于后续变异和溯源分析[10-11]。纳米孔测序技术利用碱基穿 过纳米孔时电信号的改变实现实时测序[12]，

OxfordNano?poreTechnology(ONT)公司基于该技术研发了掌上测序仪

MinION，仅有U盘大小，可通过笔记本电脑USB接口实现供电和数据生成读 取，不受外界环境和辅助设备限制，实时获得数据，按需终止测序

[13]。MinION测序也无须对核酸进行片段化，最快可在10min内完成样本建 库，并可获得更长读长，目前单条序列读长已达到882kb[14]。引起感染的 病原体种类极其复杂，使用宏基因组测序可以同时检测样本中的病毒、细 菌、寄生虫等病原体[15]，MinION在超长读长、实时测序和高便携性等方面 的优势，使其在病原体检测和疾病暴发监测方面的应用日益广泛。

1纳米孔测序技术在病原体检测与分型中的应用

Greninger等[16]首次利用MinION对4例患者血液样本进行实时宏基因组 病原检测，病毒含量为107108拷贝/mL时，410min即可完成对埃博拉病毒 和基孔肯雅病毒的检测;病毒含量为105拷贝/mL时，40min内检测到丙型肝炎 病毒，且与二代测序仪MiSeq的结果一致。该方法可将“样本~检测”的整个周 转时间缩短至6h以内，有效缩短了对传染性疾病的早期诊断的时间。

引起肝脓肿的病原体种类繁多，目前的诊断主要依赖于病原体培养，周 期长且常导致培养结果的偏倚。Gong等[17]对非培养肝脓肿样本进行纳米孔 测序以鉴定引起感染的病原体，通过差速离心去除人源完整细胞，借助DNA 酶消化去除人源线性DNA，对处理后的样本进行MinION测序，并用ONT公司的 What'sInMyPot(WIMP)生物信息分析流程进行实时病原体鉴定，在4h内识别 出样本中的肺炎克雷伯菌2个亚型，并进一步发现了emrB、macB等7个耐药基

因，极大地缩短了病原体鉴定的时间，为临床感染实时诊断与抗生素用药提 供了重要参考。

蚊子是病原体的重要传播媒介，但其携带的病原含量极其有限，为病原 监测带来极大的困难。Batovska等[18]从一例感染罗斯河病毒的白纹伊蚊中 直接提取RNA，采用MinION和MiSeq对反转录产物进行测序，前者成功测定病 毒基因组全长，且2个平台测序准确率均达到98%以上。美国佛罗里达州研究 者采用相似方法，对收集的20例库蚊样本混样后进行现场测序，检测到委内 瑞拉马脑炎病毒，并基于序列分析确定为大沼泽地病毒亚型[9]。该研究仅 需手持式qPCR仪、MinION测序仪及笔记本电脑，即可在现场完成对环境样本 的测序和生物体的种属鉴定，对仪器设备的要求低，且无需额外PCR扩增步 骤，为现场快速生物监测提供了可借鉴的方法。

疟疾作为一种重要的蚊媒传播的寄生虫传染病，现有实验室诊断方法仍 难以满足现场快速准确的检测需求。Imai等[19]针对5种可引起人类疟疾的 疟原虫的18SrRNA序列设计特异性引物，对环介导等温扩增后的产物进行 MinION测序，对疟原虫最低检测限达到每个反应体系10~100拷贝，与巢式 PCR法对疟原虫种属鉴定结果一致，但该方法对实验设备要求低，适于在实 验室条件匮乏的地区开展检测。

病毒遗传信息多以RNA为载体，现有测序技术须将RNA反转录为cDNA，易 引入碱基匹配错误或反转录偏倚，也难以了解RNA原始状态[20]。ONT公司研 发团队[21]用MinION首次完成了对酵母中poly(A)+RNA的直接测序，无须进

行反转录或扩增就可直接获得酵母全长链特异性的RNA序列。研究者进一步 对该样本RNA反转录后的cDNA分别进行MinION和MiSeq测序，3次测序结果与 酵母转录组数据的匹配均在79%以上，且RNA直接测序与反转录后测序具有较 高的相关性。Keller等[22]针对甲型H1N1病毒基因组3'端高度保守区设计探 针，用MinION对捕获的病毒原始RNA直接测序，获得

influenzarA/PuertoRico/8/1934毒株完整的编码序列，随后又用该方法对 甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1和H7N9进行RNA直接测序，与反转录后PCR和 MiSeq测序结果的一致性达98%，且超过96%的序列可以匹配到对应病毒基因 组，表明MinION在病毒RNA直接测序方面的巨大潜力，为进一步直接研究病 毒RNA进化变异和碱基修饰提供了重要参考。

长读长测序为病原体鉴定提供更高的分辨率。Peritz等[23]对大肠杆菌7 个血清型的混合DNA文库进行纳米孔测序，以测试MinION测序对大肠杆菌的 分型与鉴别能力。测序结果显示共获得63297条有效序列，平均读长为 5.9kb，过滤掉小于4.0kb的序列后剩余44245条序列。将这些序列与大肠杆 菌O抗原基因簇数据库比对，其中58条序列特异性匹配到7种血清型的O抗 原，且每一个O抗原簇至少匹配4条序列。通过与大肠杆菌全基因组数据库比 对，显示5096条(11.5%)序列为特异性匹配序列，这其中99.6%的序列与该7 种血清型匹配，仅0.4%的序列与其他血清型匹配。该方法表明MinION测序对 于复杂混合样本的病原体分型依然具有较高的分辨率，在病原体快速分型中 具有明显优势。

16SrRNA基因(1500bp)与rrn操纵子(16S-ITS-23S)是进行微生物种属鉴 定的重要标志，二代测序由于读长短难以对细菌进行更精细的分型，采用纳 米孔测序获得16SrRNA和rrn的全长序列，也有助于更全面和更快地检测复杂 生态系统中的微生物物种多样性。Cuzco等[24]利用MinION分别对葡萄球菌 样本的16SrRNA和rrn进行测序，发现两者的扩增子比对到正确物种的比例分 别达68%和~98%。为了研究微生物多样性，研究者设计新的多位点方法并利 用MinION平台对模拟样本进行16S扩增子测序，在单次测序中获得约380万条 序列，完成了对模拟样本中超过90%的16SrRNA基因序列的重建，检测到20个 不同物种，并计算出所有物种的相对丰度[25]。该课题组进一步结合多位点 与长扩增子测序方法，使用引物对样本中的rrn区域进行PCR扩增后用纳米孔 测序，最终分析和提取67000多个细菌基因组中的rrn序列，完全重建了模拟 群落中的微生物多样性，且其分型准确率优于单独基于16S、ITS或23S的分 型结果[26]

2纳米孔测序技术在疫情溯源中的应用

2014~2016年西非埃博拉疫情导致11299人死亡，引起了全世界的关注。 快速获得基因组信息有助于阐明埃博拉病毒的传播规律，然而疫区地处偏 远，缺乏良好的实验室和样本运输的条件。Loman团队[27]首次将MinION带 到几内亚疫情现场，建立基因组实时监测系统，收集并完成142例埃博拉患 者样本测序，最快可在24h内获得测序结果。基于测序数据，研究者发现几 内亚流行的病毒主要属于GN1和SL3种系，且这2个种系也出现于塞拉利昂，