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《靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促 内皮细胞迁移的抑制作用》

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文档信息

文档编号：	文-05VZ74（自定义文件编号）
文档名称：	靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞 迁移的抑制作用.doc
文档格式：	Word （*.doc，可编辑）
文档字数：	6948字，（不统计页头页脚及版权声明等文字）
文档主题：	这是一篇关于“医学心理学”中“肿瘤学”的参考范文
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靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内 皮细胞迁移的抑制作用

目录

1 材料和方法

A549细胞培养及条件培养基(conditioned mediu...

2 结果

A549条件培养基(CM)对人脐静脉内皮细胞迁移的影响

6孔培养板中已融合的HUVECs

3 讨论

参考文献

正文

摘要：目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默 作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以 人脐静脉内皮细胞为靶细胞，设计针对Akt1基因mRNA的siRNA (siAkt1)，利 用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞，采用半定量PCR技术(RTPCR) 检测Akt1 mRNA的表达，用Western blotting 技术检测Akt总蛋白表达。同 时用体外“伤口愈合”实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制 内皮细胞Akt1 mRNA(P)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而

抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用，这为肺癌血管生成干 预治疗提供了新的理论基础

关键字：肺癌RNA干扰基因Akt1内皮细胞迁移

Targeted siRNA Kept Akt1 Gene Expression Silence and Its

Inhibitory Effect on Endothelial Cell Migration Induced with Lung Cancer Cell Conditioned Medium TU Mingli1，2，3，XU

Yongjian1*，LU Jinchang2，3，FENG Jingbo3，LIU Xianjun2， XIONG Chang2，JIANG Fei2，DU Chunlin2，TANG Yijun2

(1Department of Respiratory Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong Univeity of Science and Technology，

Wuhan，Hubei 430030;2Department of Respiratory Medicine，3Ititute

of Life Science，Taihe Hospital，Yunyang Medical College，Shiyan， Hubei 442000，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of siRNA on Akt1 gene expression in endothelial cells，and its influence on the migration of endothelial cells induced with lung carcinoma A549 cells conditioned medium(CM).Methods Using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as the target cells，a siRNA sequence targeted Akt1 gene(siAkt1) was designed and trafected into HUVECs

mediated with expression of Akt1 mRNA was examined with RTPCR， and the Akt protein expression was determined with Western migration of HUVECs was obsereved with external wound healing HUVECs trafected with siAkt1 could markedly inhibited the expression of Akt1 mRNA (P).Conclusion Specific siRNA could inhibit the migration of HUVECs induced with A549 cells CM，which may provide a novel strategy for inhibiting tumor angiogenesis。

Key words:Lung cancer;siRNA;Gene，Akt1;Endothelial cells;Migration

肺癌是当今世界上发病率和死亡率都位于第一的恶性肿瘤，而非小细胞 肺癌占80%，其侵袭性生长、转移和预后依赖于血管生成。肿瘤血管生成涉 及血管结构的系列病理变化，主要包括血管内皮细胞增殖、存活和迁移，其 中血管内皮细胞向肿瘤移行是一个重要环节。Akt(蛋白激酶B/PKB)是 PI3KAkt信号传导通路中的重要信号分子，具有多种生物学活性[1]。研究 表明抑制Akt活性能诱导细胞的凋亡、抑制细胞的迁移和增殖[2]。体外实验 还发现Akt 对于血管的形成有重要作用，Akt能促进血管内皮生长因子诱导 的血管内皮细胞迁移[3]。但Akt是否参与了非小细胞肺癌调控的血管内皮细 胞增殖、凋亡和迁移，尚未见明确报道，而且对Akt亚型的作用知之甚少。 因此，本研究利用非小细胞肺癌条件培养基培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并用RNA干扰技术特异性抑

制Akt1的表达，观察Akt1在肿瘤细胞刺激HUVECs迁移中的作用，为非小细胞 肺癌抗血管生成的治疗寻找新的分子靶点。

1 材料和方法

主要试剂

LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，OptiMEM(Invitrogen公 司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(Promega公司)，胎牛 血清(FBS，Gibco公司)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF，Sigma 公司)， 兔抗人vWF单克隆抗体(Sigma公司)，TotalAkt多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)，βactin单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，碱性磷酸酶标记的二抗(北京中山公司)

细胞培养

人脐静脉内皮细胞培养：取新鲜的人脐静脉，用%胶原酶和%胰酶的混合 液(1∶4)消化血管内皮细胞，所得的细胞悬液用含20% FBS和终浓度为4

ng/mL的aFGF DMEM/F12培养基置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，约5～7 d长至 融合状态。用兔抗人vWF 进行免疫细胞化学检测，vWF阳性着色率达到95%以 上，2～4代用于实验。

A549细胞培养及条件培养基(conditioned medium，CM)收集：高转移人 肺腺癌A549细胞系由本实验室保存，在含有10%FBS的DMEM/F12培养基中培

养。待细胞至60%融合时，无血清饥饿24 h后，用5%FBS刺激24 h，无菌收集 上清，离心、过滤后，-80 ℃保存备用(A549条件培养基，A549CM)

siRNA设计、合成、转染

以NCBI GenBank提供的人Akt1(_)mRNA序列为模板，由上海吉玛生物制药 公司设计并化学合成Akt1 siRNA(siAkt1)以及Scramble siRNA(siSCR)。序

列如下：siAkt1 See 5′ggaggguuggcugcacaaatt3′，Antisee

5′uuugugcagccaacccucctt3′; siSCR See

5′uucuccgaacgugucacgutt3′，Antisee

5′acgugacacguucggagaatt3′。按照LipofectamineTM 2000说明书进行 siRNALipofectamineTM 2000混合物制备，以转染Scramble siRNA(siSCR) 组为对照，经过优化实验，最终选用siRNA浓度为40 pmol。

RTPCR检测转染后细胞内Akt1 mRNA水平

按照Trizol试剂说明书提取转染后24 h的细胞总RNA，紫外分光光度计定 量，逆转录合成cDNA。引物设计如表1。表1 扩增用的引物序列

TargetSequenceSize (bp)

(℃)CycleAkt1See:5′GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGATG3′