Chin J Clin Neurosci 2014, 22 (3), 258~263, 275中国临床神经科学 2014 年第 22 卷第3 期

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论 著

不同浓度维甲酸诱导体外培养人羊膜上皮细胞分化 为神经样细胞的研究

王 平，刘邦忠，刘光华，石明芳，杨名珍，陆志辉 ( 复旦大学附属中山医院康复科 200032)

关键词 人羊膜上皮细胞；维甲酸；诱导分化；细胞治疗

摘要 目的 探讨维甲酸诱导人羊膜上皮细胞向神经样细胞分化。方法 以 DMEM/F12 培养基培养原代人羊膜上皮细胞， 并将细胞分为 5 组：对照组； 1 × 10^-8 mol·L-1 维甲酸组； 1 × 10 -7mol·L-1 维甲酸组； 1 × 10 -6mol·L-1 维甲酸组； 1 × 10 -5 mol·L-1 维甲酸组。各维甲酸组经维甲酸处理 7 d 后，用免疫组化检测神经干细胞巢蛋白 (nestin) 、微管相关蛋白 2(MAP-2) 、 神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 和细胞全能性标记物 Oct-4 表达，并计数阳性细胞比例。结果 与对照组比较，各维甲 酸组显著提高人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的比例，其中 1 × 10^-6 mol·L-1 维甲酸组阳性细胞比例最高；结论 维甲 酸体外能诱导人羊膜上皮细胞向神经样细胞分化，最适诱导浓度为 1 × 10^-6 mol·L-1 。

Research on Inducing Human Amnionic Epithelial Cells Differentiate into Neural-like Cells with Different Concentration of Retinoic Acid in Vitro WANG Ping, LIU Bang-zhong, LIU Guang-hua, SHI Ming-fang, YANG Ming-zhen, LU Zhi-hui Department of Rehabilitation, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032,China

KEY WORD human amniotic epithelial cells; retinoic acid; differentiation; cell therapy

ABSTRACT Aim To investigate the effect of retinoic acid (RA) on the human amnionic epithelial cells. Methods The human amnionic epithelial cells are cultured in DMEM/F12 medium in vitro. The cells were divided into five groups: ① Control group; ② (1 × 10^-8 ) mol·L^-1 RA group: the cells treated with DMEM/F12 medium containing (1 × 10^-8 )mol·L^-1 RA; ③ (1 × 10^-7 )mol·L^-1 RA group: the cells treated with DMEM/F12 medium containing (1 × 10^-7 )mol·L^-1 RA; ④ (1 × 10^-6 )mol·L^-1 RA group: the cells treated with DMEM/F12 medium containing (1 × 10^-6 )mol·L^-1 RA; ⑤ (1 × 10^-5 )mol·L^-1 RA group: the cells treated with DMEM/F12 medium containing (1 × 10^-5 )mol·L^-1 RA. After 7 days, the expression of Oct-4, Nestin, MAP-2 and GFAP in the human amnionic epithelial cells were investigated by immunohistochemical technology. Results As immunohistochemical technology and Western-blotting technology showed, the expression of nestin, MAP-2 and GFAP were higher in the other groups than in the control group, which were the most in (1 × 10^-6 )mol·L^-1 RA group. The expression of Oct-4 was less in the other groups than the control group, which were the least in (1 × 10^-6 )mol·L^-1 RA group. Conclusion RA can increase the expression of Nestin, MAP-2 and GFAP, while decrease the expression of Oct-4, which means that RA can induce the human amnionic epithelial cells differentiate into neural-like cells in vitro . And (1 × 10^-6 )mol·L^-1 RA is the appropriate concentration.

[文章编号] 1008-0678(2014)03-0258-07 [中图分类号] Q189 R329.2 [ 文献标识码 ] A [作者简介] 王平 , 女 ( 1988-), 硕士 , 主要从事人羊膜上皮细胞的相关研究。 [通讯作者] 刘邦忠 ,E-mail:Liu.bangzhong@zs-hospital.sh.cn

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神经系统退行性疾病和外伤等造成神经功能损伤的 治疗已成为当前亟待解决的问题。虽然药物治疗和手术 干预取得了一定进展，但也存在诸多问题，异体移植常 带来免疫排斥反应^[1] 。目前，细胞治疗疾病这一方法逐 渐被人们熟知和重视。细胞治疗^[2] 是指利用某些具有特 定功能细胞的特性，采用生物工程方法获取和 ( 或 ) 通过 体外扩增、特殊培养等处理后，使细胞具有增强免疫、杀 死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等 治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。

目前，国内外研究多集中于干细胞向神经细胞分化 的研究，而对体细胞的研究相对较少。干细胞存在伦理 学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题^[3] 限制了其在临 床上的应用，而具有部分胚胎干细胞特性的人羊膜上皮 细胞 (human amniotic epithelial cells ， HAEC) 不存在上述 问题^[4] ，从而为细胞治疗提供了新的选择。

HAEC 是一种来源于人胎盘羊膜组织的上皮层体细 胞。研究显示 HAEC 具有部分胚胎干细胞特性，即在体 外培养下具有向 3 个胚层分化的潜能^[5] ：内胚层 ( 胰腺细 胞、肝细胞 ) 、中胚层 ( 心肌细胞 ) 和外胚层 ( 神经细胞、肌 细胞、心肌细胞，骨细胞，脂肪细胞，胰腺细胞，肝细 胞 ) 。细胞生活的微环境在分子水平决定了细胞的分化方 向^[6] ，因此在维甲酸诱导体外培养的 HAEC 向神经样细 胞分化的过程中，选择最佳维甲酸干预浓度是决定成功 与否的关键。本实验通过细胞形态学分析和检测细胞内 巢蛋白 (nestin) 、微管相关蛋白 2(MAP-2) 、胶质纤维酸 性蛋白 (GFAP) 和转录因子 Oct-4 表达，探讨维甲酸诱导 HAEC 在体外分化为神经样细胞的最适浓度，为 HAEC 在 细胞移植中的应用奠定基础。

材料与方法

材料与试剂 羊膜标本由复旦大学附属中山医院妇 产科提供，本研究经产妇本人签署知情同意书，并经中 山医院伦理委员会同意。

DMEM/F12 、特级胎牛血清、 PBS 缓冲液、青霉素 - 链霉素双抗溶液、 0.25% 胰蛋白酶 +0.02EDTA (Gibco Ltd ，美国 ) 。Ⅱ型胶原酶、 Dnase 酶 (Sigma Ltd ，美国 ) 。 鼠抗人 vimentin 单克隆抗体 (SR0746 ， EpitomicsInc ， 美国 ) 。鼠抗人 CK-19 抗体 (BM0033) 、兔抗人 Nestin 多 抗 (BA1289) 、鼠抗人 MAP-2 多抗 (BM1243) 、兔抗人 GFAP 多抗 (BA0056)( 武汉博士德生物工程有限公司，中国 ) 。 兔抗人 Oct-4 多抗 (MAB4305) (Millipore Ltd ，美国 ) 。 100 、 200 、 300 、 400 筛网 ( 上海瑞谷生物科技有限公司，中国 ) 。 羊膜组织提取和处理^[4] HIV 、梅毒、乙肝等血清

学反应阴性的足月剖宫产后胎盘，胎盘娩出后，无菌条 件下 2~4 h 将羊膜与绒毛膜分离，并将羊膜置于 DMEM/ F12 培养液内保存。羊膜上皮细胞的原代培养应在羊膜 取得后 6 h 内进行。

原代 HAECs 培养^[7] 将 5 cm × 5 cm 大小的羊膜置 于含有双抗 (100 U·mL^-1 青霉素、 100 U·mL^-1 链霉素 ) 的 PBS 中反复冲洗 3 次。然后放入不加血清的 DMEM/F12 培养基中漂洗 3 次。将漂冼后的羊膜用眼科剪剪成数小 块；再将组织块反复剪成 1 mm × 1 mm 大小。取 10 mL 羊膜组织悬液，按 1 ∶ 4 比例加入 0.25% 的Ⅱ型胶原酶， 并置于 37 ℃恒温振荡孵箱内消化 2 h 后， 1 000 r·min^-1 离心 5 min ，吸出上清液 ( 含胶原酶消化液 ) 。再加入等体 积 0.25% 胰蛋白酶 -0.02%EDTA 室温下消化 15 min ，用 含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基终止消化。 1 000 r·min^-1 离心 5 min ，去上清，用含 10% 胎牛血清的 DMEM/ F12 培养基清洗后，将细胞悬液依次通过 100 、 200 、 300 、 400 目筛网过滤，细胞计数，然后将细胞以 1 × 10⁷ 个 / mL 密度的 HAECs 悬液 2 mL 接种于 25 mL 培养瓶中， 置 5%CO2 、 37 ℃培养箱内培养。倒置显微镜动态观察细 胞形态变化及生长增殖情况。 3 d 后首次换液，以后根 据细胞生长情况，隔天换液，每次换液时去除非贴壁 细胞。待 3~4 d 后细胞融合长满时，用 0.25% 胰蛋白 酶消化，按 1 ∶ 2 或 1 ∶ 3 比例进行传代，倒置显微镜观 察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作。

原代 HAECs 的鉴定^[5] 取第 3 代 HAECs 制作细胞爬 片。常温下将细胞爬片用 PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 4% 多 聚甲醛固定 10 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 0.2%TritonX100 破膜 20 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入正常的 山羊血清室温下封闭 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 加入鼠抗人 CK19(1 ∶ 100) 抗体和鼠抗人 vimentin(1 ∶ 100) 抗体， 37 ℃孵育 2 h ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入辣根 过氧化酶标记的二抗， 37 ℃孵育 30 min ， PBS 洗 3 min ，× 3 次； DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染 2 min ， 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微 镜下观察并摄像。对照组用 PBS 代替一抗。

不同浓度维甲酸诱导 HAECs 向神经样细胞分化 消 化收集第 3 代 HAECs 制成细胞爬片，待细胞生长至 60%~70% 融合时 ( 对照组用含 10% 胎牛血清的 DMEM/ F12 培养基培养 ) ，各维甲酸组去除培养基，加入含不同 浓度维甲酸的 DMEM/F12 诱导液 ( 内含 10% 胎牛血清 ) 。

实验分组 共分为 5 组：①对照组，含 10% 胎牛血 清的 DMEM/F12 培养基处理，不含维甲酸；② 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸组 [ 含 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸 DMEM/F12 培

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养基 ( 含 10 ％胎牛血清 )] ；③ 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸组 [ 含 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸 DMEM/F12 培养基 ( 含 10% 胎牛 血清 )] ；④ 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组 [ 含 1 × 10^-6 mol·L^-1 维 甲酸的 DMEM/F12 培养基 ( 含 10% 胎牛血清 )] ；⑤ 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组 [ 含 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸的 DMEM/ F12 培养基 ( 含 10% 胎牛血清 )] 。每天换液，换液时去除 非贴壁细胞，共诱导 7 d 。

不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 Nestin 免疫组 化染色^[8] 取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂 洗 3 min ，× 3 次； 4% 多聚甲醛固定 10 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 0.2%TritonX-100 破膜 20 min ， PBS 漂 洗 3 min ，× 3 次；加入正常的山羊血清，室温下封闭 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入兔抗人 Nestin 抗 体 (1 ∶ 100) ， 37 ℃孵育 2 h ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 加入辣根过氧化酶标记的二抗， 37 ℃孵育 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； DAB 暗环境下显色；自来水冲洗， 苏木精复染 2 min ，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性 树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像， Nestin 标记 的神经样阳性细胞呈棕褐色。

不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 MAP-2 免疫组 化染色^[9] 取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂 洗 3 min ，× 3 次； 4% 多聚甲醛固定 10 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 0.2%TritonX-100 破膜 20 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入兔抗人 MAP-2 抗体 (1 ∶ 100) ， 37 ℃孵育 2 h ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 加入辣根过氧化酶标记的二抗， 37 ℃孵育 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； DAB 暗环境下显色；自来水冲洗， 苏木精复染 2 min ，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性 树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像， MAP-2 标记 的神经样阳性细胞呈棕褐色。

不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 GFAP 免疫组化 染色^[10] 取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 4% 多聚甲醛固定 10 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； 0.2%TritonX-100 破膜 20 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入兔抗人 GFAP 抗体 (1 ∶ 100) ， 37 ℃孵育 2 h ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次；加入辣根过氧 化酶标记的二抗， 37 ℃孵育 30 min ， PBS 漂洗 3 min ，× 3 次； DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染 2 min ，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置 显微镜下观察细胞并摄像， GFAP 标记的神经样阳性细 胞呈棕褐色。

不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化过程中 Oct-4 免疫 组化染色^[11] 取出细胞爬片。常温下将细胞爬片 PBS 洗 3 min ，× 3 次； 4% 多聚甲醛固定 10 min ， PBS 洗 3 min ，× 3 次； 0.2%TritonX-100 破膜 20 min ， PBS 洗 3 min ，× 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min ， PBS 洗 3 min ，× 3 次；加入兔抗人 Oct-4 抗体 (1 ∶ 100) ， 37 ℃ 孵育 2h ， PBS 洗 3 min ，× 3 次；加入辣根过氧化酶标 记的二抗， 37 ℃孵育 30 min ， PBS 洗 3 min ，× 3 次； DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染 2 min ，梯 度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜 下观察细胞并摄像， Oct-4 标记的神经样阳性细胞呈棕 褐色。

图像分析 随机取 10 个不同视野 ( × 100) ，以每个 视野内阳性细胞数为量化指标，每组视野阳性细胞数量 作为该组 HAECs 诱导分化为神经样阳性细胞密度代表 值，以阳性细胞数 /100 倍视野表示。

统计学方法 采用 SPSS17.0 统计软件进行统计学 分析。各组计量资料以 ± s 表示。各组间比较采用单因 素方差分析，以 α =0.05 为检验水准， P <0.05 为差异有 统计学意义， P <0.01 为差异有显著统计学意义。

结 果

体外培养 HAECs 细胞的生长特性 倒置显微镜下 观察细胞在贴壁前轮廓清晰、体积较小、圆形、透亮、折 光性较强、富有立体感。接种 23 d 后贴壁，细胞逐渐 变大，折光性降低，整个细胞轮廓变暗，完全伸展的细 胞形态多样，呈梭形、多角形、眼睛样等，轮廓清晰，胞 质丰富，胞核居中，可见 12 个核仁，呈圆形、卵圆形。 接种 3 d 后，人羊膜上皮细胞进入指数生长期，细胞数 量明显增多，呈不规则多角形。接种 57 d 时 90% 细胞 融合成片，形成单层放射状或漩涡状生长，开始进行传 代。传代 6 h 后即可贴壁，细胞 34 d 融合长满，形成 单层放射状或漩涡状单层细胞。传至 2~5 代，细胞形态、 大小、活性均匀一致。传至 6 代以后少数细胞形态发生 变化，呈不规则形，细胞增殖减慢。传至第 8 代细胞胞 质内出现空泡和黑色颗粒，细胞增殖能力减弱，逐渐停 滞生长，凋亡并从瓶壁脱落。第 3 代细胞融合后数量恒 定，符合实验要求，取第 3 代细胞作为实验对象。

体外培养细胞的来源鉴定 上皮细胞标记物 CK19 标记的贴壁细胞胞质内有大量棕褐色物质，胞核呈蓝紫 色 ( 图 1A) ；间质细胞标记物波形蛋白 (vimentin) 标记 的贴壁细胞胞质内仅有少量棕褐色物质，胞核呈蓝紫 色 ( 图 1C) 。

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图 1 原代 HAECs 鉴定 ( × 200)

Fig 1 Identification of the HAECs by immunocytochemistry technology( × 200)

注： A 为免疫组化检测贴壁细胞内上皮细胞特异性标记物 CK 19 的表达； B 为对照组； C 为免疫组化检测贴壁细胞内间质细胞特异性标记 物波形蛋白的表达； D 为对照组

Notes ： A. Immunohistochemistry to CK19 as a specific marker of the epithelial cells ； B. The blank control group ； C. Immunohistochemistry to vimentin as a specific marker of the mesenchymal cells ； D. The blank control group

不同浓度维甲酸对 HAECs 分化作用的影响

1. 不同浓度维甲酸组 HAECs 分化的形态学变化：对 照组细胞形态未发生改变； 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸组少数 细胞形态有所改变，胞质回缩，胞体伸出轴突样长突起； 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸组部分细胞形态发生改变，出现 双极或多级细胞，少数细胞在突出末端出现分支； 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组出现较多双极或多级细胞，部分细 胞出现突起并相互连接成网； 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组细 胞胞质出现空泡或黑色颗粒状物，大量细胞固缩脱落。

2. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组 HAECs 诱导 分化细胞的 Nestin 阳性细胞 ( 图 2 ， 3) 表达率：对照组 为 (12.12 ± 0.37)% ， 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸组为 (15.13 ± 0.28)% ， 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸组为 (17.56 ± 1.15)% ， 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组为 (20.98 ± 0.95)% ， 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组为 (19.20 ± 3.12)% 。不同浓度维甲酸组与对照 组比较，均差异有显著统计学意义 ( P <0.01) ；不同浓度 维甲酸组组间比较，除 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组、 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组外 ( P =0.15) ，其他组均差异有显著统计

学意义 ( P <0.01) 。

3. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组 HAECs 诱导分 化细胞的 MAP-2 表达率 ( 图 2 ， 3) ：对照组为 (14.12 ± 1.04)% ， 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸组为 (22.81 ± 1.32)% ， 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸组为 (24.21 ± 1.65)% ， 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组为 (29.56 ± 1.35)% ， 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组 为 (24.34 ± 3.85)% 。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均 差异有显著统计学意义 ( P <0.01) ；不同浓度维甲酸组组间 比较，除 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组、 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲 酸组外 ( P =0.23) ，其他组均差异有显著统计学意义 ( P < 0.01) 。

4. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组 HAECs 诱导分 化细胞的 GFAP 表达率 ( 图 2 ， 3) ：对照组为 (11.23 ± 0.26)% ， 1 × 10^-8 mol·L^-1 维甲酸组为 (13.21 ± 0.60)% ， 1 × 10^-7 mol·L^-1 维甲酸组为 (15.63 ± 1.18)% ， 1 × 10^-6 mol·L^-1 维甲酸组为 (22.69 ± 1.62)% ， 1 × 10^-5 mol·L^-1 维甲酸组 为 (15.79 ± 3.31)% 。不同浓度维甲酸组与对照组比较， 均差异有显著统计学意义 ( P <0.01) ；不同浓度维甲酸组

图 2 对照组培养细胞内 Nestin 、 MAP-2 、 GFAP 和 Oct-4 的变化 ( 免疫组化， × 100)

Fig 2 Cultured cells of Nestin, MAP-2, GFAP and Oct-4 in control group (Immunocytochemistry ，× 100)

注：对照组细胞形态为梭形、多角形、眼睛样等，形态未发生改变，以细胞内出现棕褐色颗粒为染色阳性， Nestin 、 MAP-2 、 GFAP 染色阳 性 ( 箭头所示 ) 细胞数较少， Oct-4 染色阳性 ( 箭头所指 ) 细胞数较多 Notes ： Control group ： The human amnionic epithelial cells (hAECs) were cultured in DMEM/F12 medium (including 10% FBS) without retinoic acid (RA) for 7 days. Spindle-shaped or polygon or eye-liked cells were seen under microscope. Cells with brown granules in their nucleus are positive as taken stained, the number of Nestin, Microtubule-associated protein-2 (MAP-2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive cells was a few, while the number of Octamer-binding protein-4(Oct-4) positive was a lot