骨碎补提取工艺优化研究

Optimization of Extraction Process of Drynaria fortunei

目 录

摘要**....................................................................................................................................- 3 -- 3 -**
Abstract.....................................................................................................................................III
1 前言**...........................................................................................................................................4**
2柚皮苷在骨碎补提取物中的含量测定方法建立**.....................................................................6**
2.1 实验方法及结果....................................................................................................................6
2.1.1 仪器、试剂与材料.............................................................................................................6
2.1.2 检测波长.............................................................................................................................6
2.1.3 色谱条件.............................................................................................................................7
2.1.4 溶液的制备.........................................................................................................................7
2.1.5 工作曲线的绘制.................................................................................................................7
2.1.6 方法学考察.........................................................................................................................8
2.2 本章小结..............................................................................................................................10
3骨碎补提取工艺优化研究**.......................................................................................................11**
3.1 实验方法及结果..................................................................................................................11
3.1.1 仪器、试剂与材料...........................................................................................................11
3.1.2 骨碎补醇提实验研究.......................................................................................................11
3.1.3 骨碎补水提实验研究.......................................................................................................17
3.1.4骨碎补最优提取工艺确定.................................................................................................22
3.2 本章小结..............................................................................................................................22
结论**.........................................................................................................................................XX4**
参考文献**.......................................................................................................................XXIXXIV**
致谢**...............................................................................................................................XXXXIVI**
独创声明**......................................................................................................................XXXXIVII**

摘 要

目的： 对骨碎补提取工艺进行优化，并建立柚皮苷含量测定的方法。 方 法： 运用HPLC法对提取物中柚皮苷含量进行测定，在单因素实验的基础上，通 过柚皮苷含量和L9（34）正交实验表，优选出骨碎的工艺条件，进而通过比较 柚皮苷含量确定最优工艺。 结果： HPLC法测定柚皮苷含量经方法学考察结果证 明，该方法稳定，可靠；正交实验结果得出骨碎补提取的最优工艺提取条件 为：用12倍量的纯化水，每次提取150 min，共提取3次。 结论： 优选出了骨碎 补提取的最佳工艺。

关键词： 骨碎补；柚皮苷；HPLC法

II

Abstract

Objective: to take advantage of the extraction process of Drynaria and make a method for the determination of naringin. Methods: Measurement of naringenin content by HPLC method has been proved through methodological tests, which is stable and reliable.On the basis of single factor experiment,the best process conditions of bone crushing were optimized by the content of naringin and L9 (34) orthogonal experimental table, and then the optimal process was determined by comparing the content of naringin. Results: HPLC method for the determination of naringin was proved to be stable and reliable by the results of the investigation of the traditional Chinese medicine. Conclusion: the best extraction technology of Drynariae was optimized.

Keywords: Drynaria fortunei rhizome; Naringin; HPLC

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前 言

中药一直是我国的宝贵财富，近些年来随着国民消费水平的增高，各类中成药 的市场需求不断增大，中药质量也随之变得更为重要。而影响中药质量的其中一个 因素就是中药提取，不同的提取方法会影响药材提取物中有效成分的含量，而适宜 的提取方法可以提高提取物中有效成分的含量。中药提取方法包括很多，如传统方 法和现代方法。基于此本文选择对骨碎补提取工艺进行研究并优选出最佳工艺，提 高药材的利用减少浪费。

1.1 骨碎补研究概况

骨碎补，为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎^[1] 。查阅文献可知从骨碎补中分离得 到的物质主要有黄酮类、三萜类、酚酸类、木脂素及甾体类等其主要活性成分是柚 皮苷和新北美圣草苷^[2] 。并且骨碎补所含总黄酮类成分近些年来受到很多关注在预 防治疗阿尔兹海默病方面^[3] 。Yang等人的研究发现骨碎补根茎水提物逆转了Aβ25-35 诱导的小鼠皮层神经元轴突的萎缩，这有助于修复受损的神经元网络从而改善AD模 型小鼠的记忆缺陷^[4] 。

1.2 骨碎补提取工艺

对于骨碎补，以往研究人员通过多种多样的提取方法对其进行提取，比如溶剂 提取法：王婷婷以50%、55%、60%、70%、80%乙醇作为提取溶酶，对骨碎补总黄 酮进行提取，发现其含量较高是浓度在50%~60%之间的乙醇溶液作为提取溶酶时 [5]。张海茹将乙醇浓度、用量、取时长和提取次数作为四个因素，以L9(34)正交表进 行正交实验，确定最佳工艺为60%乙醇浓度10倍量、总提取3次、单次持续150min， 提取后其总黄酮平均含量为30.14μg/mL^[6] 。陈丰连等人针对提取时间长短和溶剂的 变化对柚皮苷被提取率影响大小的研究，发现以水作为提取溶酶所得提取物中柚皮 苷含量高于醇作为提取溶酶所得提取物中柚皮苷含量^[7] 。除了溶剂提取法，研究人

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员还运用超声辅助提取法、超声提取法、索氏提取法、回流提取法对骨碎补进行提 取^[8-11] 。

1.3 中药高效液相指纹图谱

高效液相指纹图谱根据中药中所含成分的极性不同，在色谱之上的吸附能力相 同，采用梯度洗脱法就能控制不同极性化合物的出峰时间，从而将中药中不同化合 物分离开来。具有分离效率高，分析速度快，稳定性好等特点的高效液相色谱指纹 图谱在控制原药材质量及制剂质量方面已被广泛应用。上海中医药的张永等人建立 了不同生长年限肉桂药材的指纹图谱，其中有9个特征峰被标定，6个特征峰被识别 [12]。Zhu Lili等人采用HPLC法对20批来自不同产地的木瓜样品进行了分析，最后得 出木瓜色谱指纹图谱具有较高的特征性和专一性，可用于木瓜质量控制^[13] 。

2柚皮苷在骨碎补提取物中的含量测定方法建立

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2.1 实验方法及结果

2.1.1 仪器，试剂，材料

2.1.1.1 仪器

高效液相色谱仪	1260	Agilent
数控超声波清洗	KQ-500DE	昆山市超声仪器有限公司
器
电子天平 2.1.1.2试剂	BP211D	德国Sartorius
柚皮苷	110722-201815	中国食品药品检定研究院
甲醇	色谱纯	北京迪科马科技有限公司
冰乙酸 2.1.1.3材料	色谱纯	天津市光复精细化工研究所
骨碎补	市售	黑龙江中医药大学鉴定

2.1.2 检测波长

由图2-1所示，经液相分析而且结合DAD检测器进行200-400nm的全波长扫描

后，柚皮苷最大紫外吸收波长在284 nm处，供试品与对照品紫外光谱图的形状相同

• （200-400 nm之间）溶剂无吸收（在284 nm）。

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1.对照品；2.供试品；3.溶剂

图 2-1 UV 光谱图

2.1.3 色谱条件

色谱柱为Shimpack VP-ODS(4.6mm╳250mm，5μm)；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min^-1 ；进样量为12 μL；流动相为甲醇-醋酸-水（35:4:65）。

2.1.4 溶液的制备

用甲醇溶解后的一定量的柚皮苷，配制成为浓度是0.1 mg·mL^-1 的对照品溶液。 供试品溶液时将提取液进行旋转蒸发浓缩，后将其进行水浴蒸干溶剂，取适量

的甲醇，加入其中进行溶解，置100 mL容量瓶加甲醇定容，取续滤液（精密量取） 2 mL置容量瓶加甲醇定容至25mL。

2.1.5 工作曲线的绘制

向50mL容量瓶中加柚皮苷溶液（0.1 mg·mL^-1 ），分别是加入1、2、4、8、10 mL，然后加甲醇定容至刻度。由图3-2与柚皮苷的回归方程经线性关系拟合得到： y=19.852x-3.3871，r=0.9997，上述结果说明浓度为2-20 μg·mL^-1 的柚皮苷，具有良好

的线性关系。

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图 2-2 柚皮苷标准曲线

2.1.6 方法学考察

专属性考察依照“2.1.3”条件进样，由图2-3可知，于8.32 min处，供试品溶液与

对照品溶液均出现色谱峰，并且无溶剂峰干扰，该方法具有很好的专属性。

图 2-3 高效液相色谱图

1.对照品；2.供试品；3.溶剂

精密度考察 对照品依照“2.1.3”“2.1.3”色谱条件连续进样6，记下峰面积。如表2-1所 示，RSD=0.52%，仪器精密度良好。

对照品依照“2.1.3”“2.1.3”色谱条件连续进样6，记下峰面积。如表2-1所

表 2-1 精密度实验结果

实验次	柚皮苷浓度（μg·mL-	均值	（μg·mL-	RSD
数	1）	1）		（%）
1	19.97
2	19.90
3	20.14	1	9.95	0.52
4	19.85
5	19.94
6	19.89

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重复性考察 如表2-2所示，由6组按上述方法制备的供试品并按上述色谱条件进

样后记下的峰面积得到柚皮苷浓度的RSD=0.65%，证明上述方法有很好的重复性。

表 2-2 重复性实验结果

实验次	柚皮苷浓度（μg·mL-	均值（μg·mL-	RSD
数	1）	1）	（%）
1	8.28
2	8.20
3	8.16	8.24	0.65
4	8.26
5	8.22
6	8.30

稳定性考察 。如表2-3所示，根据“2.1.4”所述的制备方法的供试品依次在

0、5、15、20、24 h时进样，5组实验柚皮苷峰面积RSD=0.66%，证明所制供试品溶

液可持续保持稳定24h。

表 2-3 稳定性实验结果

时间间隔	柚皮苷浓度	均值（μg·mL-	RSD(%
（h）	（μg·mL-1）	1）	)
0	8.30
5	8.27
15	8.25	8.24	0.66
20	8.18
24	8.18

加样回收率考察 将已知浓度的供试品溶液精密量取4ml并与1 ml的20.12μg·mL^-

1的柚皮苷溶液于10 mL的容量瓶中，以甲醇定容至刻度线，取配置好的溶液进样测

定。回收率 = 。如表 2-4 所示，平均回收率 =97.97% ，

RSD=1.70%，此方法回收率良好。

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