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土壤RNA提取方法研究进展*

刘 华¹ 申天琳^{2, 3} 李学坤² 付合才^{2, 3} 戴九兰^1**

（¹山东大学环境研究院 济南 250100）

（²山东大学生命科学学院生态学与生物多样性研究所 济南 250100）（³山东大学山东省植被生态工程技术中心 济南 250100）

摘 要 总RNA提取是进行实时荧光定量PCR、Northern杂交分析及cDNA文库建立等分子生物学实验研究的基础. 提取出高质量高产量的土壤RNA已成为研究土壤微生物的关键步骤. 综述了常用的几种土壤RNA提取方法，包括强变性剂法、Trizol法、CTAB法、SDS-Phenol法、酶解法以及试剂盒等方法. 提取过程中化学试剂的选择及配比需依据不同的土壤类型，其中Trizol法在提取总RNA时应用广泛，再结合适当的物理破碎及生物学方法，可得到理想的RNA. 试剂盒法提取土壤RNA方便快捷，纯度高但产量低，且对土壤具有选择性. 最后提出了土壤RNA提取过程常见的一些问题和注意事项，为土壤RNA提取方法的选择提供依据. 参56

关键词 土壤微生物；RNA提取方法；裂解；RNase

CLC S154.3

Progress of Researches on Extraction Methods of Soil RNA*

LIU Hua1, SHEN Tianlin2, 3, LI Xuekun2, FU Hecai2, 3 & DAI Jiulan1*

(1Environment Research Institute, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

(2Institute of Ecology and Biodiversity, School of Life Sciences, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

(3Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Vegetation Ecology, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

Abstract RNA plas an important role in studyin environmental microbes because it can indicate the characteristics of the activated microorganism. The extraction of total RNA is the basis of real-time fluorescence quantitative PCR, northern hybridization analysis, cDNA library creation and other molecular biology studies. How to obtain a high yield and quality soil RNA is the critical step for the research of soil microbes. Therefore, several RNA isolation methods which can obtain high quality RNA from soil were summarized in this article, includin stron denaturant method, Trizol method, CTAB method, SDS-phenol method, enz e decomposition method and commercial RNA extraction kits. The various combinations of above methods for RNA isolation from soil were often used. Amon_g the above methods, stron_g denaturant is _good RNase inhibitor, and CTAB can cause the protein denaturation. However, bead beatin_g is the efficient physical lysis method. Compared with other methods, mechanical homogenization in Trizol is the most efficient for releasing microbial RNA. The different RNA extraction kits have their characteristics for different soils. Furthermore, the influence factors, application aspects, as well as the potentials and the limitations for the extraction of total RNA were also reviewed. Therefore, this work ma_y provide the _guidelines for RNA isolation and the choice ofmethod to study soil microbes. Ref 56

Keywords soil microbe; RNA extraction method; l_ysis; RNase

CLC S154.3

提取纯度高和完整性好的RNA是研究微生物表达组学的重要前提. 在土壤微生物研究中，过去的研究主要集中在土壤DNA提取及其下游反应，土壤DNA的提取可用于所有微生物的研究，包括一些处于休眠状态的孢子，而无法检测到当前有活性的微生物状态. 然而，基于土壤RNA的分析能更好地描述种群的代谢活性，研究表明，由细胞产生的rRNA量与细菌的生长活性是一致的[1~2]. 随着环境因子发生改变，RNA会在第一时间作出反应. 因此，探索土壤RNA提取方法，已成为近年来土壤微生物分子生物学研究的热点.

总RNA提取是分子生物学研究的基础，在进行实时荧光定量PCR、Northern杂交分析、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等研究时均需要高质量的RNA [3~5]. 近年来，以16SrRNA分析为基础的未培养微生物研究技术的发展大大拓展了微生物研究范围，并通过基因测序全面深入地反应微生物群落特性[6~7]，而对于土壤RNA提取方法，常用的有强变性剂法、CTAB法、Trizol法、SDS-phenol法以及一些试剂盒等方法. 土壤中提取RNA时常会有相应的腐殖质被一起提取出来，进而会严重影响核苷酸的提取质量[8~9]. 另外，与提取DNA相比，RNA的提取过程中增加了使核糖核酸酶（RNase）失活这一关键步骤，以防止 降解. 因此，RNA的提取研究土壤微生物的特性虽然有了很大的发展，但是还存在一些障碍.

RNA的提取方法大致可分为以下3部分：ⅰ）细胞裂解，ii）从周围基质中提取RNA，iii）纯化；并且因土壤类型的不同而不同. 在提取过程中最重要的是裂解过程[10]. 因此，本文根据不同裂解方式对RNA的提取方法进行了分类，对常用土壤RNA提取基本方法进行了综述，并分析了各种方法的优缺点，为选择合理有效的提取方法提供理论依据，以及为土壤微生物研究提供重要的方法来源.

应用与环境生物学报 2011，17 ( 6): 918~922Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X

2011-12-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00918

收稿日期：2011-01-21 接受日期：2011-03-11

*国家自然科学基金项目（No. 40801088）、山东省自然科学基金项目 （No. Q2008B09）和山东省环境保护重点科技项目（No. 2006007）资 助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 40801088), the Provincial Natural Science Foundation of Shandon_g, China (No. Q2008B09), and the Ke_y Project of Environmental Protection Science of Shandon_g (No. 2006007)

**通讯作者 Correspondin_g author (E-mail: daijiulan@sdu.edu.cn)

1 常用土壤RNA提取方法及特点

1.1 强变性剂法

强变性剂通常包括异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚等物质，异硫氰酸胍是强烈的蛋白变性剂，它不仅能强烈抑制RNase的活性，还能有效地解离核蛋白与核酸的复合体，与加入的β-巯基乙醇和N-月桂酰肌氨钠（Sarkos_yl）共同对RNase产生强烈的抑制作用[11]. 该方法的优点在于提取液中有强烈的蛋白变性剂，能强烈抑制RNase的活性，可用于提取大量的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的总RNA.

上世纪90年代研究者尝试用洗涤剂等变性剂溶解细胞膜的方法[12~13]，Tsai等人从土壤中提取mRNA，裂解缓冲液含有0.1 mol/L巯基乙醇、4 mol/L的硫氰酸胍等物质，溶解土壤微生物的细胞膜进一步提取RNA，这种方法可得到较高产量的总RNA [14]. Mendum等采用4 mol/L异硫氰酸胍强变性剂法，加入2% N-月桂酰肌氨钠等缓冲液裂解样品，在有效抑制RNase活性的同时分离土壤中革兰氏阴性菌的mRNA，终产物mRNA可直接用作RT-PCR模板[15]. Hurt等研究了裂解液的组成以及研磨条件对RNA提取质量的影响，结果表明，加入变性剂4 mol/L异硫氰酸胍能够防止RNA降解，抑制RNase的活性，提高产物RNA的提取质量[16]. 然而，相对于Trizol法提取微生物的RNA，异硫氰酸胍法耗时长，不适用于大量样品的提取[17].

1.2 Trizol试剂快速提取法

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，可以直接从细胞或组织中提取出高总产量的总RNA[18~21]. 结合液氮研磨可获得更好的裂解样品[22].

研究表明，机械研磨破碎法和化学试剂裂解法（如Trizol）相结合提高了裂解效率[23]，研磨更有利于土壤均质化，细菌更容易与土壤胶体分离，有效地破碎细菌细胞壁[24]. 金敏等采用溶菌酶、Trizol 和氯仿结合进行细胞的裂解和抽提，获得的RNA在产量、性能、微生物多样性等方面均较好，可用于大量样品的处理[49]. Culle 等探索了几种化学裂解及机械破碎法对巴氏甲烷八叠球菌RNA提取的影响，结果表明在加入Trizol之前进行液氮研磨，以及适当的玻璃珠破碎可最大限度的裂解细胞，得到高产量的目的RNA [25].

1.3 CTAB法

CTAB（Cet ltrimeth lammonium bromide）是一种非离子去污剂，较高浓度的CTAB可沉淀核酸和酸性多聚糖，并且可以有效地裂解细菌的细胞壁，同时与巯基乙醇共同作用使蛋白变性[26]. 因此，在提取含有大量多聚糖的有机体中的核酸时（如某些革兰氏阴性菌），利用CTAB作为裂解液是可行的 [ 2 7 ]，再 结 合 于 物 理 的 玻 璃 珠 破 碎 法（B e a d b e a t i n _gmethod），这是一种激烈的细胞裂解方法，在FastPrep均质破碎仪中激烈振荡^[28~29]，可使土壤中微生物的细胞壁彻底破

裂，从而有效地分离出RNA.

Griffiths首先采取了一种直接快速的方法从土壤中有效地提取RNA和DNA，而这种方法即是利用变性剂CTAB结合于玻璃珠破碎法的有效裂解方式，用FastPrep FP120彻底地裂解土壤样品, 并用16S rRNA的RT-PCR和16S rDNA-PCR方法研究微生物群落多样性[30~31]. 另外，如果在进行Beadbeatin_g之前用酒精处理土壤基质[32]，不仅能降低核苷酸的降解还更能保证产物DNA和RNA的产量及完整性.

Helmut等同样也采用0.2% CTAB和1 mmol/L 1,4-DTT以及磷酸缓冲液（pH 8.0）作为裂解液结合玻璃珠破碎法提取土壤mRNA，用于研究固氮菌nifH的基因表达[33]. 粗提RNA用DNase处理可得到高产量的RNA，此方法用于研究土壤中有活性的微生物是可行的. 但是在基因水平上研究固氮菌的nifH 并不能很好地显示固氮功能，必要的时候要与分子技术和酶活性测定技术相结合来研究复杂的微生物群落.Popova研究反刍动物瘤胃里消化物质的核苷酸基因表达情况[34]，即参考Griffiths（2000）用CTAB和玻璃珠破碎法提取出高质量和高产量RNA，对反刍动物瘤胃中微生物群落的生态学研究有重要意义.

1.4 SDS-phenol法

SDS（Sodium dodec_yl sulfate）的主要作用是使核蛋白与核酸复合物分离，并与β-巯基乙醇、苯酚等共同抑制RNase的活性，使蛋白质变性. 苯酚（Phenol）是一种易燃、腐蚀性强、毒性强的化合物，能够快速使蛋白质变性，但是不能完全抑制RNase的活性，可用苯酚 : 氯仿 : 异戊醇（25 : 24 : 1）有效地去除蛋白质、脂类、多聚糖以及一些细胞碎片. SDS-phenol法可在抑制RNase的同时，使蛋白质等变性，再结合玻璃珠物理破碎法，可有效地裂解土壤样品，用以大量提取土壤总RNA [35~39].

Biddle [39]、Lloyd [40]等用phenol（pH 5.0）、20% SDS等缓冲液作为裂解液提取沉积物的rRNA，并用FastPrep FP 120均质破碎细胞，可有效地提取出RNA，以研究沉积层生态系统中微生物的功能代谢. Jahn等用热SDS-phenol法可获得完整性较好的细菌RNA，用于基因表达的研究[41]. 研究表明，利用20% SDS及其他缓冲液和变性剂作为裂解液，结合玻璃珠激烈振荡破碎，可有效提取土壤中的RNA，研究担子菌类漆酶基因的表达情况[42]，也可用于检测红球菌属bphAa基因的表达情况[43].

1.5 酶解法

酶解细胞壁和细胞膜的方法也是提取土壤RNA的方法之一. 主要是利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将土壤微生物的细胞壁分解，使细胞内含物释放出来. 有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解. 研究表明，在提取过程中经强烈振荡和温浴，加入蛋白酶K可提高RNA产量[44]，Moran等人采用Tris裂解液及溶菌酶溶解细菌细胞壁[45]，可提取沉积物和土壤中的rRNA，用于生态学研究.

2 常用的土壤RNA提取试剂盒

为方便研究者提出更高质量的土壤RNA，国内外很多试剂公司开发出便于提取土壤RNA的试剂盒. 主要有Qia_gen公司生产的RNeas_y Mini Kit，美国MOBIO公司生产的RNAPowerSoil™ Total RNA Isolation Kit，OMEGA公司生产的E.Z.N.A.® 土壤RNA提取试剂盒，以及Invitro en公司生产的TRIzol® Max™ Bacterial RNA Isolation Kit. 这些是目前国际上使用率较高的土壤RNA试剂盒，市面上还有一些其他公司生产的试剂盒也在科研实验室中投入使用.

6 期

刘 华等：土壤RNA提取方法研究进展

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Dineen等人以土壤中噬菌体MS2的RNA提取为例，对常用的几种土壤RNA提取试剂盒包括The PowerSoilTM TotalRNA Isolation (MO BIO)，E.Z.N.A.®Soil RNA, FastRNA®Pro Soil-Direct (Ome_ga Bio-Tek)，FastRNA® Pro Soil-Indirect(MP Biomedicals)，以及 IT 1-2-3 Platinum PathTM kits (MPBiomedicals)进行了评估，标准包括耗费成本、操作时间以及贮存条件等[46]. 研究结果表明，沙土适合E.Z.N.A.®Soil RNA试剂盒，黏土适合用IT 1-2-3 Platinum PathTM kits试剂盒，而较肥沃的土壤，FastRNA® Pro Soil-Indirect和IT 1-2-3 PlatinumPathTM kits这两种试剂盒适用. 另外，IT 1-2-3 Platinum PathTMSample Purification kit不需要特定的温度，不需要额外的处理，可适用于更广泛的领域. Jacobsen等尝试用改进的FastRNA Pro Soil Direct Kit（裂解改用bead beatin_g）提取土壤中沙门氏菌的mRNA [47]，结果表明，RNA纯度不足以进行下游PCR反应，若采用与选择性磁性捕获钳杂交（Ma_gneticcapture hybridization，MCH） 技术相结合，可有效去除腐殖酸[48]，得到纯度较高的mRNA.

金敏等比较研究了一些细菌RNA提取试剂盒，包括Ome_ga 公司的 E. Z. N. A 细菌 RNA 提取试剂盒、Invitro_gen公司的 TM Micro-to-Midi 细菌RNA提取试剂盒、中国某公司的IntekT M细菌总RNA提取试剂盒提取细菌RNA，具体操作方法按照各试剂盒中说明[49]. 结果表明，Invitro en 公司的试剂盒提取的RNA产率最高且丰度最大，其次是Ome_ga 公司试剂盒，中国某公司的试剂盒提取的RNA产率和丰度最低. T-RFLP检测图谱显示，这3种不同试剂盒提取法获得的T-PF长度主要分布50~100、100~200、400~500bp. 不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同，这可能主要是由于它们对细菌的破壁处理方法不同，不同试剂盒各自配带的离心柱对 的回收效率也影响 的最终产量.

试剂盒法提取土壤RNA虽然方便快捷，可得到高纯度的RNA，但产量较低，费用高，且不同的试剂盒提取结果差异较大，对不同的土壤具有选择性. 因此，运用此种方法提取土壤RNA具有一定的局限性.

3 土壤RNA提取过程中常见问题及解决办法

3.1 RNA的降解

实验室常用的普通玻璃器皿、塑料制品和电泳槽等器材必须保存在RNA实验专用处，使用前要严格清洗，离心管等塑料制品要用DEPC水处理或者直接买商品化的无RNase的离心管和枪尖. 用于凝胶电泳的电泳槽、制胶盘等用3%双氧水浸泡20~30 min可以有效去除RNase，彻底冲洗后才能使用[50].

实验中用的各种试剂，也是污染源之一. 建议直接购买无RNase活性的溶液，或者用RNase抑制剂（如DEPC）处理.另外，要尽量做到现用现配 在进行RNA提取实验时，实验人员自身的污染也是重要的RNase污染源. 要注意及时更换手套，带口罩，减少对RNA的污染.

3.2 产量低的问题

土壤RNA的提取往往得不到高的产量，所以在提取过程中要尽量熟练操作，缩短提取时间. 并且尽量在低温下操作，减少RNA的降解[51]. 加入RNA稳定剂，如Ambion公司和Qian_gen公司研制的RNALaterTM试剂和RNA protect BacteriaRea ent（Qian en），可以有效地稳定RNA[52]， 沉淀时选择用3 mol/L NaAc可有效沉淀出RNA，将DNA留在溶液中，从而提高RNA的提取质量[53]. 提取土壤RNA时，裂解液的pH值也可影响最后RNA产物的纯度，Wan_g等研究发现相同温度下，pH值越高提取产物的腐殖酸含量越高；同一pH值条件下，温度越高腐殖酸含量也越高[54]. 因此，在低温、低pH值条件下，可获得高产量、高质量的RNA.

4 小结与展望

RNA提取是分子生物学研究的基础，如何提取出高质量的土壤RNA更是研究土壤微生物的关键. 只有提取出产量高、纯度高的RNA，才能更好地进行下游反应. 目前国内外已有很多专门用于土壤RNA提取的方法，主要可分为两类，一类是依据特殊的溶液（如Trizol）来提取RNA，另一类则是依据离心柱. 这些方法大多被开发成商业化的试剂盒，从而简化提取工艺[55].

化学的裂解方法各有优势，如何选择裂解方法需要依据不同的土壤类型，Trizol试剂法在提取总RNA时应用较多，再结合于适当的物理破碎以及生物的方法，可得到高产量的产物. 然而，玻璃珠破碎法是一种有效的物理裂解方法[56]，其缺点在于需要特定仪器的支持. 另外，根据土壤的特征，可灵活地选择化学试剂的配比来裂解样品. 随着科学技术的发展，土壤RNA的提取技术将会越来越方便、快捷、高效.

References

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应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol

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