中国药理学与毒理学杂志 ２００４年 ２月； １８（１）：２２－２６ ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ ２００４ Ｆｅｂ； １８（１）：２２－２６

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Ｄ半乳糖和三氯化铝诱导小鼠产生类阿尔茨海默病变

罗焕敏 ，肖 飞

（暨南大学药学院神经药理学研究室，广东广州 ５１０６３２）

摘要：目的 探讨 Ｄ半乳糖和三氯化铝（ＡｌＣｌ３^）联 合使用制备阿尔茨海默病动物模型的可能性。方法 昆明种小鼠，腹腔注射 Ｄ半乳糖（６０ｍｇ·ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ ） 和灌胃 ＡｌＣｌ３^（５ｍｇ ·ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ ）每天 １次，连续 ９０ｄ。 给药结束后，通过 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫、生化指标测定、ＲＴ ＰＣＲ及常规 ＨＥ染色和 Ａβ１－４０免疫组化染色，观察 Ｄ半乳糖和 ＡｌＣｌ３^{对小鼠学习记忆、胆碱能系统及} 脑内β淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）、早老素 １（ＰＳ１）、β位 点 ＡＰＰ内切酶（ＢＡＣＥ）基因表达的影响，并观察海 马、皮质的形态学改变。结果 Ｄ半乳糖和 ＡｌＣｌ３ 共同作用导致小鼠学习记忆力减退；脑内 ＡＣｈ含量 下降，ＡＣｈＥ活性升高；ＡＰＰ，ＰＳ１和 ＢＡＣＥ基因表达 增强；海马和皮质老年斑形成。结论 Ｄ半乳糖和 ＡｌＣｌ３^{联合使用可使小鼠产生类阿尔茨海默病变，该} 方法可用于制备阿尔茨海默病动物模型。 关键词：Ｄ半乳糖；三氯化铝；阿尔茨海默病；学 习；记忆；模型

中图分类号：Ｒ９６５．１

文献标识码：Ａ

文章编号：１０００３００２（２００４）０１００２２０５

阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种 以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的脑退行 性疾病。老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ）、神经原纤维缠结 （ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ）和基底前脑胆碱能神经元丢失 为 ＡＤ的主要病理特征。研究表明 ＡＤ患者脑组织 中铝含量增高，用原子吸收光谱仪测得铝在健康人 脑内为（１．８±０．８）ｍｇ·ｇ^－１ （脑组织干重），ＡＤ患者脑 · 内铝的含量是（３．６±２．９）ｍｇ·ｇ^－１ 。而一般 ＞４ｍｇ

收稿日期：２００３０５２０ 接受日期：２００３０８２１

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２７１５０２） 作者简介：罗焕敏（１９６０－），男，江西赣州人，副教授，医 学博士，主要从事神经药理学研究。

联系作者 Ｅｍａｉｌ：ｔｌｈｍ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎＴｅｌ：（０２０） ８５２２０２６３Ｆａｘ：（０２０）８５２２０１６０

ｇ^－１ 即可引起神经细胞变性^［１］ 。 Ｄ半乳糖（Ｄｇａｌａｃ ｔｏｓｅ）可造成小鼠亚急性衰老早有报道^［２］ 。本研究拟 将两者结合起来同时施予小鼠，探讨铝和 Ｄ半乳糖 对脑的综合毒性作用，以期为制备更加贴近人类 ＡＤ 的动物模型提供依据。

１ 材料与方法

１．１ 动物

雌性昆明种小鼠，体重 ２０～２２ｇ，由广东省医学 实验动物中心提供，合格证号：２００１Ａ０４５。标准鼠饲 料常规喂养。

１．２ 仪器设备和试剂

冷冻高速离心机和 ＤＵ６４０型核酸蛋白分析仪 为 Ｂｅｃｋｍａｎ公司生产；ＤＹＺ３２Ｃ型水平电泳槽为北京 六一公司生产；ＵＮＯⅡ型 ＰＣＲ仪为 Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司产 品；ＭｕｌｔｉＧｅｎｉｕｓ型凝胶成像分析系统为 Ｓｙｎｇｅｎｅ公 司产品。乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）测定试剂盒由南京 建成生物工程研究所生产；Ｄ半乳糖（生化试剂）为 ＡＭＳＣＯ公司产品；ＡｌＣｌ３^{（分析纯）为广州化学试剂厂} 产品；兔抗小鼠β淀粉样蛋白１－４０（ａｍｙｌｏｉｄβｐｒｏｔｅｉｎ １－４０，Ａβ１－４０）抗体和 ＳＡＢＣ免疫组化染色试剂盒均 由武汉博士德公司提供；焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）为上 海生物工程有限公司产品；ＴＲＩＺＯＬ由 Ｌｉｆｅ公司生 产；一步法逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）试剂盒和 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）均为 Ｔａｋａｒａ公司产品。

１．３ 实验方法

小鼠适应性饲养 １周后，随机分为空白对照组 和给药组，每组 ２０只。给药组 ｉｐＤ半乳糖 ６０ｍｇ· ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ （生理盐水配制）和 ｉｇＡｌＣｌ３^５ｍｇ ·ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ （双蒸水配制），连续 ９０ｄ；空白对照组 ｉｐ等量的生 理盐水和 ｉｇ等量的双蒸水。

给药 ９０ｄ后，采用 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫法测试学习记 忆能力^［３］ 。连续测试 ５ｄ，每天上、下午各测 １个单 元，共 １０个单元。在前 ９个单元，每只小鼠每单元 测试 ４次，记录各次潜伏期。在第 １０单元，撤除平

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台，记录小鼠在原平台所在象限停留时间。行为实 验结束后，小鼠取全脑，制成 １０％脑匀浆，分别用于 下列检测。

羟胺比色法测定全脑乙酰胆碱（ＡＣｈ）含量^［４］ ； ＤＴＮＢ法测定 ＡＣｈＥ活性，操作步骤按试剂盒说明书 进行。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。

根据 ＧｅｎＢａｎｋ的序列，用 Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件分别设 计β 淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄβｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ， ＡＰＰ）、早老素 １（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１，ＰＳ１）、β位点 ＡＰＰ内切酶 （βｓｉｔｅＡＰＰｃｌｅａｖｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＢＡＣＥ）基因的引物，内参 基因β肌动蛋白（βａｃｔｉｎ）引物购自鼎国生物公司， 其他引物均由上海生物工程公司合成。常规方法提 取全脑 ＲＮＡ；应用半定量 ＲＴＰＣＲ技术检测 ＡＰＰ， ＰＳ１和 ＢＡＣＥｍＲＮＡ的含量。

另做全脑切片，ＨＥ染色和 Ａβ１－４０免疫组化染 色，光学显微镜下观察。

（Ｐ＜０．０１）。

２．２ 全脑组织乙酰胆碱含量及乙酰胆碱酯酶活性 测定

由表 ２可看出，两组间蛋白质含量没有显著性 差异。与空白对照组比较，给药组 ＡＣｈ含量明显下 降，ＡＣｈＥ活性明显升高。

Ｔａｂ２．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３^{ｏｎａｃｅｔｙｌ} ｃｈｏｌｉｎｅ（ＡＣｈ）ｃｏｎｔｅｎｔａｎｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＡＣｈＥ） ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｗｈｏｌｅｂｒａｉｎ

Ｇｒｏｕｐ	Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎ ／ｇ ·Ｌ－１	ｔ ＡＣｈ／ ｍｇ ·ｇ－１	ＡＣｈＥ／ｍｍｏｌ · ｍｉｎ－１·ｇ －１
Ｃｏｎｔｒｏｌ	２．９９±０．３０	３８４±２７	１．１７±０．２５
ＤＧａｌａｃｔｏｓｅ＋ＡｌＣｌ ３	２．８１±０．２５	１４０±３１	３．１５±０．３４

ＳｅｅｌｅｇｅｎｄｏｆＴａｂ１ｆｏｒｍｉｃｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０． Ｐ＜ ０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ．

１．４ 统计学处理

数据以珋ｘ±ｓ表示，使用 ＳＰＳＳ１０．０统计软件处 理，用 ｔ检验进行两组间比较。

２ 结果

• ２．３ 脑内 ＡＰＰ，ＰＳ１和 ＢＡＣＥ基因表达的变化 从表 ３和图 １可看出，给药组 ＡＰＰ，ＰＳ１和

• ＢＡＣＥｍＲＮＡ含量与内参照基因β肌动蛋白 ｍＲＮＡ 含量的百分比值均较空白对照组明显升高。

２．１ 学习记忆能力测试

由表 １可看出，两组小鼠逃避潜伏期随测试日 期推移而逐渐缩短，至 ｄ５已趋稳定，说明已接近潜 伏期极限，再增加测试天数已不能明显提高成绩。 给药组小鼠在 ｄ４和 ｄ５逃避潜伏期均明显长于空 白对照组。

当 ｄ５下午撤除平台后，给药组在平台所在象 限停留时间为（１８±５）ｓ，占总测试时间的（３０± ９）％，明显短于空白对照组的（３０±４）ｓ和（５０±７）％

Ｔａｂ３．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３^{ｏｎｅｘｐｒｅｓ} ｓｉｏｎｏｆａｍｙｌｏｉｄβｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ＡＰＰ），ｐｒｅｓｅ ｎｉｌｉｎ１（ＰＳ１）ａｎｄβｓｉｔｅＡＰＰｃｌｅａｖｉｎｇｅｎｚｙｍｅ（ＢＡＣＥ） ｇｅｎｅｓｉｎｗｈｏｌｅｂｒａｉｎ

Ｇｒｏｕｐ	ＡＰＰ∶ βａｃｔｉｎ／％	ＰＳ１∶ βａｃｔｉｎ／％	ＢＡＣＥ∶ β ａｃｔｉｎ／％
Ｃｏｎｔｒｏｌ	４１±６	２８±３	１０３±１４
ＤＧａｌａｃｔｏｓｅ＋ＡｌＣｌ ３	９４±８	６３±６	１６９±１３

ＳｅｅｌｅｇｅｎｄｏｆＴａｂ１ｆｏｒｍｉｃｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝６． Ｐ＜

０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ．

Ｔａｂ１．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄａｌｕｍｉｎｕｍｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡｌＣｌ３ ｗａｔｅｒｍａｚｅ

３^{）ｏｎｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙｏｆｍｉｃｅｔｅｓｔｅｄｂｙＭｏｒｒｉｓ}

Ｇ			Ｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙ／ｓ
ｒｏｕｐ
	ｄ１	ｄ２	ｄ３	ｄ４	ｄ５
Ｃｏｎｔｒｏｌ	３１±１０	２２±９	２０±９	１０±５	９±３
ＤＧａｌａｃｔｏｓｅ＋ＡｌＣｌ ３	３８±１２	２９±１３	２６±１２	２１±１２	２１±１０

ＭｉｃｅｗｅｒｅｇｉｖｅｎＤｇａｌａｃｔｏｓｅ６０ｍｇ·ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ ，ｉｐ，ａｎｄＡｌＣｌ３^５ｍｇ ·ｋｇ^－１ ·ｄ^－１ ，ｉｇ，ｏｎｃｅｄａｉｌｙｆｏｒ９０ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｇｉｖｅｎｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｏｆｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ，ｉｐ，ａｎｄｄｏｕｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ，ｉｇ，ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ．ＴｈｅｎＭｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｅｓｔｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙ ｏｆｍｉｃｅｆｏｒ５ｄ．Ｔｗｏｂｌｏｃｋｓ（ｆｏｕｒｔｅｓｔｓｉｎａｂｌｏｃｋ）ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｆｒｏｍｄ１ｔｏｄ４，ｏｎｅｉｎｔｈｅｍｏｒｎｉｎｇａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｉｎｔｈｅａｆｔｅｒｎｏｏｎ．Ｔｈｅｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｉｅｓｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄａｓｔｈｅｍｅａｎｏｆａｌｌ８ｔｅｓｔｓｉｎｏｎｅｄａｙ．Ａｔｄ５，ｊｕｓｔｏｎｅｂｌｏｃｋｉｎｔｈｅｍｏｒｎｉｎｇｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝１６０（８ｔｅｓｔｓ ｅａｃｈｍｏｕｓｅ，２０ｍｉｃｅ）ａｔｄ１ｔｏｄ４，ｎ＝８０ａｔｄ５． Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ．

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Ｆｉｇ１．Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｍｙｌｏｉｄβｐｒｏ ｔｅｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１ａｎｄβｓｉｔｅＡＰＰｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．Ｓｅｅｌｅｇｅｎｄｏｆ Ｔａｂ１ｆｏｒｍｉｃｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．１Ａａｎｄ２Ａ：ｃｏｎｔｒｏｌ；１Ｂａｎｄ２Ｂ：Ｄ ｇａｌ＋ＡｌＣｌ３^{ｇｒｏｕｐ；Ｍ：ｍａｒｋｅｒ．ＡＰＰ：４６７ｂｐ；ＰＳ１：４３６ｂｐ；} ＢＡＣＥ：１５４ｂｐ；βａｃｔｉｎ：３００ｂｐ．

２．４ 形态学变化

给药约 ６０ｄ时，已有部分小鼠出现弓背、毛发 稀疏、行动迟缓等衰老征象。给药 ９０ｄ，取小鼠全 脑，切片，常规 ＨＥ染色显示，各组没有明显病理改 变和差异。Ａβ１－４０免疫组化染色显示，空白对照组 反应阴性，说明 Ａβ１－４０在正常状态下几乎不表达或 表达量极微。而给药组在海马及皮质均可见较多β 淀粉样蛋白（Ａβ）沉积形成的老年斑（图２），其周围

Ｆｉｇ２．Ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ（Ａ）ａｎｄｃｏｒ ｔｅｘ（Ｂ）．ＳｅｅｌｅｇｅｎｄｏｆＴａｂ１ｆｏｒｍｉｃｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ａβ１－４０ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．

可见肿胀变形的神经元。另见少量 Ａβ样免疫反应 阳性神经元，阳性产物主要位于神经元核周及突起。

３ 讨论

铝元素诱导动物脑内发生病理变化已有报道， 但剂量和时间不一致，剂量为 １０．８～５００ｍｇ·ｋｇ^－１ ， 时间从 ６周到 ３个月不等^{［５，６］} 。本研究通过预试发 现小鼠给予 ＡｌＣｌ３^{１０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１，３个月便有动物} 死亡。因此在正式实验时采用“降低剂量，延长时 间”的方案，所用剂量为 ５ｍｇ·ｋｇ^－１ ，给药 ９０ｄ。动物 长期注射 Ｄ半乳糖后，由于后者代谢产物半乳糖醇 不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导 致细胞肿胀，代谢紊乱，体内活性氧增多，细胞膜脂 质受损，以致机体多器官、多系统功能衰退，这些现 象均与老龄变化非常相似。 Ｄ半乳糖还引起脑神 经元的一系列退行性改变，包括神经元数目减少、脑 组织中超氧化物歧化酶活性下降、丙二醛和脂褐素 水平升高^［７］ 。 Ｄ半乳糖造成动物衰老的剂量为 ６０～１８０ｍｇ·ｋｇ^－１ ，时间从 ６周到 ３个月不等。

用 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫进行学习记忆力测试，表明 Ｄ 半乳糖和 ＡｌＣｌ３^{确能引起小鼠学习记忆力下降。} ＡＣｈ是中枢胆碱能系统重要的神经递质，研究证实， 其含量的高低与学习记忆能力呈一定的正相关。多 数研究表明 ＡＤ患者脑内胆碱乙酰转移酶（ＣｈＡＴ）活 性降低，ＡＣｈＥ活性升高，ＡＣｈ含量不足，学习记忆能