项目编号：
项目类别：
农业转基因生物中间试验 申报书
项目名称：重组毕赤酵母X33/ pPICZαC- PoIFNα表达的猪干扰素α
在广东省的中间试验
申请单位：广东大华农动物保健品股份有限公司
申请人：罗满林
地 址：广东省云浮市新兴县温氏科技园
邮政编码：527400
电 话：0766-2986103 传 真：0766-2986102
e-mail：hnsyluoml@163.com
(最终修订版)α中间试验定稿版（.doc
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填报日期：2011年10月10日 中华人民共和国农业部制
填 写 说 明
1 ．在填写申报书之前，应认真阅读《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生 物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》等有关法规，了解相关要求 。
2 ．此申报书同样适用于法规规定的报告类实验研究和中间试验的报告，名称分别改为
“ 农业转基因生物实验研究报告书 ” 和 “ 农业转基因生物中间试验报告书 ”。
- 3 ．申报书内容应当包括以下部分：申请表 、 项目内容摘要 、 工作目的和意义 、 国内外
研究的相关背景资料 、 安全性评价 、 试验方案 、 相关附件资料 、 本单位农业转基因生物安 全小组审查意见 、 本单位审查意见 、 所在省（市 、 自治区）的农业行政主管部门的审查意 见 。
4 ．申请实验研究的，申请表按表 2 填写，项目名称应包含转基因性状 、 受体生物名 称 、 实验研究所在省（市 、 自治区）名称和实验研究阶段等内容，如 “ 转基因抗虫棉花在河 北省的实验研究 ”。 一份申报书只能包含同一物种的受体生物和相同的转基因性状 。“ 安全 性评价 ” 可不填写 。“ 试验方案 ” 包括研究目标 、 外源基因的名称和来源 、 载体构建图谱 、 转 化方法和规模 、 地点 、 安全控制措施等 。“ 相关附件资料 ” 包括法人证书和营业执照的复印 件，若涉及合作项目，应提交双方合作或转让协议等 。“ 所在省（市 、 自治区）的农业行政 主管部门的审查意见 ” 可不填写，申报材料报送农业部时，抄送实验研究所在省（市 、 自治 区）的农业行政主管部门 。
5 ．申请中间试验的，申请表按表 2 填写 。 申报书中 “ 安全性评价 ”、“ 试验方案 ” 和 “ 相关
附件资料 ” 依照《农业转基因生物安全评价管理办法》附录 I、II、III 要求逐条填写 。“ 所在省
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- （市 、 自治区）级农业行政主管部门的审查意见 ” 可不填写，申报材料报送农业部时，抄送
中间试验所在省（市 、 自治区）级农业行政主管部门 。
6 ．申请环境释放和生产性试验的，申请表按表 2 填写；申报书中 “ 安全性评价 ”、“ 试验
方案 ” 和 “ 相关附件资料 ” 依照《农业转基因生物安全评价管理办法》附录 I、II、III 要求逐条填
写 。 对于已批准过的环境释放或生产性试验，在试验结束后，若同一转基因生物在原批准
地点以相同规模重复试验，在申报时 “ 安全性评价 ” 部分可省略 。
7 ．申请农业转基因生物安全证书的，申请表按表 3 填写；申报书中 “ 安全性评价 ” 和 “ 相
关附件资料 ” 依照《农业转基因生物安全评价管理办法》附录 I、II、III 要求逐条填写， “ 试验
方案 ” 不用填写 。
8 ．申报书应当用中文填写，一式十份，一律使用 A4 纸，正文用小四宋体打印，标准字
间距和单倍行距，并提供光盘 。 对于不符合要求的申报书，不予受理 。
9 ．申请者可以注明哪些资料需要保密并说明理由 。
10 ．受理时间：每年 3 次，截止日期分别为 3 月１日 、7 月 1 日和 11 月 1 日 。
11 ．受理单位：农业部行政审批综合办公室科教窗口 。 地址：北京市朝阳区农展馆南
里 11 号 。 邮政编码： 100125。 收款单位：农业部科技发展中心；开户行：中信银行北京朝 阳支行；帐号： 7111110189800000419。
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目 录
| 一、申请表......................................................................................1 |
|---|
| 二、项目内容摘要...........................................................................3 |
| 三、工作目的和意义........................................................................3 |
| 四、国内外研究的相关背景资料......................................................4 |
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| 五、安全性评价...............................................................................7 |
|---|
| 六、试验方案.................................................................................18 |
| 七、相关附件资料.........................................................................21 |
| 八、本单位农业转基因生物安全小组审查意见..............................49 |
| 九、本单位审查意见......................................................................50 |
| 十、所在省（市、自治区）的农业行政主管部门的审查意见.........50 |
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一、农业转基因生物中间试验申请表
| 项 目 |
项目名称 | 重组毕赤 试验 |
酵母X33/ pPICZα | C- PoIFNα | 表达的猪干扰素α在广东省的中间 |
|---|---|---|---|---|---|
| 概 | 项目阶段 | 实验研究 中间试 |
验√ 环境释 |
放 生产性试验 (选√) |
|
| 况 | 项目来源 | 广东温氏 | 科研基金C080711 | ||
| 类 别 |
动物 | 植物 | 微生物√(选√) | ||
| 中文名 | 毕赤酵母 | 学 名 |
Pichia pastoris | ||
| 受体生物 | 分类学 地位 |
酵母菌科毕赤 酵母属 品 系 |
种（品 ）名称毕赤 |
酵母X33 安全等级 Ⅰ |
|
| 名 称 |
猪α干扰素 | 供体生物 | （猪）人工合成 | ||
| 目的基因1 | 生物学 功能 |
具有广泛 | 的抗病毒作用 | ||
| 转 | 启动子 | AOX1基因启动 子 |
终止子 | 转录终止子（5'AOX1和3'AOX1） | |
| 名 称 |
供体生物 | ||||
| 基 | 目的基因2 | 生物学 功能 |
|||
| 因 | 启动子 | 终止子 | |||
| 生 | …… | ||||
| 物 | 载 体1 |
pMD18-T | 供体生 | 物 | 大肠杆菌 |
| 载 体2 |
pPICZαC | 供体生 | 物 | 毕赤酵母 | |
| 概 | …… | ||||
| ﹡标记基因1 | 名 称 |
Zeocin+ | 供体生物 | 轮枝链霉菌 | |
| 况 | 启动子 | 终止子 | |||
| 标记基因2 | 名 称 |
供体生物 | |||
| ﹡ | 启动子 | 终止子 | |||
| …… |
名 称 |
供体生物 | |||
| ﹡报告基因1 | 启动子 | 终止子 | |||
| ﹡报告基因2 | 名 称 |
供体生物 | |||
| 启动子 | 终止子 |
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……
名称 来源
调控序列 1
功能
名称 来源
调控序列 2
功能
转基因方法 电转 基因操作类型 2
转基因生物品系（株系）名 X33/ pPICZαC- 转基因生物品系
5
称 PoIFNα （株系）个数
转基因生物
Ⅰ 转基因生物产品安全等级 Ⅰ
安全等级
试验 试验 1 2012年1月～2012年7月，广东省新兴县，试验猪40头，分4组
起止
试验 2
时间
地点 ……
规模
广东大华农动物保健品股份有
单位名称 地 址 广东省云浮市新兴县温氏科技园
限公司
邮 编 527400 电 话 0766-2986362
申
传 真 0766-2986362 电子邮件 gddhn@163.com
请
境内单位（事业 企业 中外合作 中外合资 外方独资 ）
单 单位性质
境外单位（企业 其它 ） ( 选 √)
位
申请人姓名 罗满林 电 话 13672427836
概
传 真 0766-2986102 电子邮箱 hnsyluoml@163.com
况
联系人姓名 汤钦 电 话 159076624123
07662986362（兼办公电话
传 真 电子邮箱 tangqin0307@gmail.com
用）
注：1．进口转基因生物直接申请安全证书的，“试验概况”一栏不用填写 。
2 ．申请人指所申请项目的安全监管具体负责人 。
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二、项目内容摘要
干扰素（Interferon，IFN）不仅具有广谱的抗病毒作用，还具有抗肿瘤和 免疫调节等功能。本实验应用毕赤酵母（Pichia pastoris）新型真核表达系 统,依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，以人工设计合成的干扰素α成熟肽 核苷酸为模板，PCR扩增出猪α干扰素的成熟肽基因。将目的片断与连接载体 pMD18-T连接，再克隆入表达载体pPICZαC，得到重组表达质粒pPICZαC-IFNα，重组表达质粒pPICZαC-IFN-α转化毕赤酵母工程菌X-33，通过抗性筛选出具 重组的酵母菌。经非洲绿猴肾细胞(Vero)—水泡性口炎病毒(VSV)系统测定重组 猪α 干扰素的效价。经过密码子改造所表达的猪α 干扰素效价达到 5.87×107 U/L。在实验室条件下将获得的表达产物接种猪后，能有效抵抗高致病 性蓝耳病毒的攻击，降低发病率和延缓发病时间；本项目在前期工作基础上， 进一步开展中间试验，以评估该表达产物对常用实验动物和本动物（猪）的安 全性，考查对周围生态环境的影响，以期能开发出一种安全有效、广谱的抗病 毒制剂。
三、工作目的和意义
我国是世界养猪大国，猪年存栏约10 亿多头。随着养猪业规模化、集约
化的发展，近年来猪圆环病毒（PCV2）病和猪繁殖与呼吸道综合征（PRRS）等 病毒病出现，尤其是这些病毒感染造成的免疫抑制，导致猪群发生多种病原体 的混合感染，猪的死亡率8%～10%或更高，每年因此造成了巨大的经济损失。干 扰素(Interferon, IFN)是一类动物机体产生的多功能分泌性蛋白，具有抗病 毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学功能。干扰素传统的生产方法是由中草药等诱 生剂诱导产生，因其纯化工艺复杂，产量低、作用缓和等诸多因素影响并限制 了在临床上的应用。为了突破原基因密码子的表达量较低缺陷，我们依据毕赤
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酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计合成新的猪α干扰素 成熟肽核苷酸序列,构建重组酵母表达质粒pPICZαC-IFN-α，并在毕赤酵母中对 猪α干扰素实现正确表达，利用Vero-VSV系统对猪α干扰素的抗病毒活性进行了 对比检测，发现密码子经改造后，分泌的猪α干扰素具有更高的抗病毒活性。
利用基因工程技术大规模生产重组干扰素，并在规模化生产中推广应用， 必将促进养猪业的发展和畜牧业的进步。本研究是在前期实验室成功构建重组 表达酵母菌的基础上进行中间试验，以能够明确猪干扰素α的临床安全性和代谢 规律，为临床生产的规模化应用提供科学依据。
四、国内外研究的相关背景资料
1957年，IsaacsA和LindemalmJ发现鸡胚尿囊膜与热灭活的流感病毒接触
后能产生一种可溶性蛋白，干扰活流感病毒繁殖，于是将其命名为干扰素 (Interferon，IFN)【1】 。干扰素具有抗病毒、调节细胞生长、抑制肿瘤血管形 成以及调节免疫等多种功能，这些生物学功能的正常发挥有赖于细胞多种信号 传导通路的开放、功能基因的转录和相互协同。
1965年，Toriorelso首次利用猪血白细胞制备了猪α干扰素【2】 。1986年， Lefevre等率先在基因水平上开始了对猪α干扰素的研究，测出其中2个基因的基 因序列：PoIFN-αl和PoIFN-α2【3】 。研究发现猪IFN一α全基因为570bP，编码 189个氨基酸，其中前23个氨基酸为信号肽，后166个氨基酸为成熟活性蛋白;随 后，他们又成功地在大肠杆菌中表达了猪α-干扰素，用单抗亲和层析后的抗病 毒活性为5-10×107 U/mgMDBK细胞。重组猪α-干扰素的抗病毒活性比天然猪白细 胞干扰素至少高6倍。以原核表达的IFN-α/β能对FMDV产生较好的抑制效果。
国内对猪α-干扰素的研究相对滞后，2001年陈涛等采用AS-PCR方法和SOE 技术相结合的策略，通过找出猪α干扰素基因内部的特异位点，设计引物扩增出 两个DNA片段并将其连接为全长基因【4】 。此后，陈涛、谢海燕、曹瑞兵、陈国
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华、陈瑞爱、刘占通等人相继又克隆了许多新的猪α-干扰素基因并在原核表达 系统中表达。例如曹瑞兵等(2004)克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中 进行了其成熟蛋白的单纯表达，表达产物具有较高的抗病毒活性【5】 。2005 年，葛丽等利用毕赤酵母分泌表达了猪α-干扰素。经细胞毒性试验检测，表达 产物的抗病毒活性为4.1×104 U/ml【6】 。杜以军等利用猪IFN-α的成熟蛋白基因 构建了重组腺病毒质粒pAd-PoIFN-α转染HEK-293A细胞，滴度为107 TCID50/mL。RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可 以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠 定了重要基础【7】 。2007年华中农大系统地克隆了猪的3种干扰素，并利用毕赤 酵母和腺病毒及真核细胞等多种系统中进行了表达【8】 。综上所述，可见目前 全国研究单位和生物公司均有意对不同动物的干扰素进行系统研发，该药品已 成为各大生物公司看中的热门话题和有发展前景的领域。
目前，在兽医临床上应用较广的兽用干扰素是猪白细胞IFN。猪白细胞IFN 是一种高活性、多功能的生物活性蛋白，具有强烈的免疫调节作用，可明显提 高机体的抗感染能力。种属特异性不是很严格，它在异种细胞上可表现强的抗 病毒活性。研究表明，猪白细胞IFN对猪的许多病毒性传染病如流行性腹泻、猪 瘟、传染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟，羔羊腹泻等都具有不错 的疗效，试验证实猪干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。姜天童应用猪白 细胞IFN配合相关抗菌药物防治猪高热病，对猪的预防作用取得了满意的效果， 保护率为92.65%100%【9】 。猪白细胞IFN治疗高致病性蓝耳病，配合抗生素治 疗一个疗程35天，效果较好(文传良，江开成，朱传梅等，2009) 【10】。通过 使用猪白细胞IFN对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、圆环病毒混合感染的治疗试验发 现，用药后, 病猪基本好转, 再无新增病例。在猪白细胞IFN防治乳猪流行性腹 泻试验中，用猪白细胞IFN对人工感染PEDV 的乳猪进行防制试验，通过临床观
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